세포 용해를위한 소니케이션(초음파 처리 분해) 프로토콜

초음파 처리 세포 용해를 위한 방법

초음파 처리 란 무엇인가?

초음파 처리 는 샘플의 입자를 휘젓는 데 사운드 에너지를 적용합니다. 사용되는 초음파 주파수는 일반적으로 20kHz 이상입니다. 실험 환경에서 이는 일반적으로 초음파 수조 또는 초음파 프로브를 사용하여 수행됩니다.

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- RIPA 버퍼 레시피 및 샘플 준비
- 단백질 추출을 위한 초음파 처리의정서
- 박테리아 초음파 처리 분석
- 처리 힌트 및 팁

초음파 처리 프로토콜 개요

실험실에서 초음파 처리은 주로 세포 분열의 방법으로 사용된다. 초음파 처리은 세포막을 파괴하고 세포 내용물을 방출하는 데 사용되며, 이 과정을 일반적으로 sonoporation이라고 한다. 초음파 처리은 세포를 분열시키기 위해 단백질 추출물을 준비하는 동안 수행된다. 용해 완충제를 사용할 수 있지만 초음파 처리은 세포를 분해하는 데 도움을 줄 수 있다. 초음파 처리은 또한 DNA를 단편화/분해하는 데 사용될 수 있으며, 추가 샘플 준비를 방해하는 것을 방지할 수 있다. 다른 생물학적 용도로는 나노입자, 리포좀, 안토시아닌의 추출, 항산화제 등이 있다.

화학적 봉쇄

이름에서 알 수 있듯이, 이 방법은 대사 반응을 차단하기 위해 티미딘과 같은 화학 물질을 사용한다. 이것은 주로 세포 주기의 S상 동안 DNA 합성의 억제를 통해 달성될 수 있다. 티미딘, 아미노페린, 하이드록시유레아 및 사이토신 아라비노사이드와 같은 저해제는 다양한 효과를 가질 수 있다. 혈청이 24시간 동안 당신의 세포를 굶기면 G1 단계에서 세포가 축적될 것이다. 혈청 기아의 효과는 세포 동기화가 발생한 후 혈청을 배지에 첨가함으로써 역전될 수 있다.

당신의 세포 유형(세균 또는 진핵생물)에 따라 특정 세포 유형을 용해시키는 것이 어려울 수 있으며 세제 완충액에 그것들을 넣는 것만으로는 완전한 세포 용해를 초래하지 않을 것이다. 또한 세포질을 방출하기 위해 세포벽을 용해시키는 것뿐만 아니라 세포기질을 용해시키는 것도 필요할 수 있다. 티타늄 탐침을 이용한 세포의 초음파 처리은 세포를 완전히 용해시키고 모든 세포의 모든 DNA, RNA, 단백질 성분을 추출하는 것을 도울 수 있다. 이것은 ELISA 분석과 immunoprecipitation을 위한 보다 동질적인 추출물을 찾을 때 다운스트림에 도움이 될 수 있다.

아래의 초음파 처리 절차에 따라 세포 용해를 수행할 경우 필요한 애플리케이션에 적합한 세포의 효율적인 용해를 달성해야 합니다.

RIPA 버퍼 레시피 및 샘플 준비

RIPA 버퍼

50mM Tris HCL pH 7.4
50 mM NaCl
2mM EDTA
1% SDS
새로 첨가된 단백질 분해 효소 억제제(아포프로틴, 루펩틴, DTT 및 PMSF) 추가

샘플 준비 사전 초음파 처리

차가운 얼음 PBS로 세포를 씻어라.
PBS를 흡인합니다.
멸균 피펫 팁을 사용하여 부착된 셀을 플레이트에서 긁어냅니다.
얼음처럼 차가운 PBS의 셀을 일시 중단합니다

단백질 추출을 위한 초음파 처리의정서

단계	묘사
1.	셀을 270 x g의 마이크로 원심분리기에서 5분간 원심분리한다.
2.	나머지 배지에 Aspirate하고 30~100 μL의 RIPA buffer에 셀을 다시 서스펜드합니다.
3.	펠릿을 얼음 위에서 30분 동안 배양한다.
4.	다음과 같이 샘플에 Sonicate.
5.	초음파 처리기케이블을 20kHz의 주파수로 배치합니다.
6.	셀을 1.5 mL micro centrifuge tube에 넣고 초음파 처리기 용기 끝 아래로 부드럽게 이동합니다.
7.	프로브가 점도를 낮추기 위해 버퍼를 2 X 10초 동안 진동시키기 시작합니다(이 경우 샘플에 거품이 발생할 수 있습니다)
8.	그러나 이 프로토콜에서 샘플의 거품은 우리가 immunoprecipitation, 웨스턴 블로팅 또는 ELISA 분석을 진행했을 때 초음파 검사 후 문제가 없는 것으로 나타났다.
9.	샘플과 샘플의 점도에 따라, 셀은 추가로 10초 동안 다시 sonicated 될 수 있습니다
10.	일단 샘플이 sonicated 되면 5분간 얼음 위에 올려놓는다.
11.	10,000 x g에서 20분간 원심분리하여 펠릿 파편(Debris는 분해되지 않은 세포, 핵 또는 분해되지 않은 세포를 포함할 수 있음).
12.	상등액을 새 마이크로 원심분리기 튜브와 라벨로 옮깁니다.
13.	-20 °C에서 보관

박테리아 초음파 처리 분석

단계	묘사
1.	얼음 냉간 Sodium Tris-EDTA (STE) 완충액 50ml(10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM PMSF로 보충된 150 mM NaCl)에 BL21 세포의 Sarkosyl 분석과 샤페론 단백질 BL21 박테리아 펠릿 제거를 다시 중단시켰다.
2.	리소자임 500ul (10 mg/ml)을 넣고 얼음 위에서 15분간 배양한다.
3.	DTT 500ul과 Sarkosyl 7ml(STE 버퍼에서 10%(w/v))를 추가합니다.
4.	모든 정화 버퍼는 얼음을 차게 유지하고 샘플은 얼음 위에 유지해야 합니다. 모든 정화 조치는 가능한 한 차가운 방에서 수행되었다.
5.	Sonicate 는 각 초음파 처리사이에 2분 간격으로 3 x 30초 동안 작동합니다.
6.	추가 정제 단계를 위해 샘플을 얼음 위에 두거나 -80°C에 보관하십시오.

초음파 처리 힌트 및 팁

1. 항상 얼음 위에 샘플을 보관하세요. 샘플을 분해하는 초음파 처리기의 에너지도 샘플을 가열합니다. 샘플이 너무 뜨거워지면 단백질이 분해되기 시작합니다. 이러한 문제를 방지하기 위해 가능하면 샘플을 항상 얼음 위에 보관하도록 하십시오.

2. 펄스를 사용하여 샘플의 온도를 낮춥니다. 대부분의 초음파 처리기에는 초음파 처리중 샘플의 가열을 줄이는 펄스 모드가 있습니다. 펄스를 사용할 수 없는 경우 초음파 처리기를 5초간 켠 다음 끕니다. 필요한 만큼 반복합니다.

3. 너무 오래 Sonicate하지 마세요. 샘플을 너무 오래 초음파 처리하면 단백질이 저하될 수 있습니다. 완벽한 균형을 찾는 데는 최적화가 필요할 수 있으며 세포/조직 유형과 샘플 볼륨에 따라 달라질 수 있습니다.

4. 샘플 볼륨 및 프로브 크기. 사용하는 프로브는 표본 크기에 따라 다를 수 있습니다. 각 프로브에는 권장 샘플 볼륨 범위가 있습니다. 작은 팁(마이크로 팁)은 작고 얇은 용기 내에서 샘플을 처리하는 것이 좋으며 50ml보다 큰 샘플은 절대로 사용하지 않는 것이 좋습니다. 마이크로팁은 짧은 처리 시간을 위해 만들어집니다. 마이크로팁은 소량으로 상당한 양의 열을 발생시키므로 열 축적을 방지하기 위해 펄스 모드에서 사용해야 합니다.

5. 귀를 보호하세요. 비록 초음파 처리이 초음파이고 사람이 들을 수 있는 범위 밖에 있지만, 에 의해 만들어진 작은 캐비테이션 기포의 붕괴는 큰 끽끽거리는 소리를 낸다. 우리는 적절한 귀 보호대를 착용하고 귀를 막고, 단순히 여기서 귀를 자르지 않는 것을 제안합니다.

6. 거품이 나는 것을 제한하도록 하세요. 프로브가 샘플에 제대로 잠겨 있지 않으면 거품이 발생할 수 있지만 너무 깊으면 제대로 분석되지 않습니다. 만약 거품이 생긴다면 당황하지 말고 immunoprecipitation, 웨스턴 블로팅 또는 ELISA 분석을 진행했을 때 거품이 문제가 되지 않는다는 것을 알게 되었습니다.

7. 느리고 꾸준한 것이 진폭에 관한 한 경주에서 승리한다. 모든 실험과 마찬가지로 최대 전압까지 크랭킹하거나 절반의 시간 내에 셀을 변환하려는 유혹이 강합니다. 그러나 이것이 항상 발표 가능한 결과를 초래하지는 않습니다. 초음파 처리의 경우 진폭이 작을수록 샘플의 발열이 감소하므로 다른 실험을 계속해야 할 이유가 있습니다. 진폭과 강도는 직접적인 관계가 있습니다. 결과를 재현하기 위해서는 샘플의 진폭 설정, 온도, 점도 및 부피가 모두 일정하게 유지되어야 합니다. 초음파 처리 결과를 재현할 때는 전력이 아닌 진폭이 가장 중요합니다.

8. 검체 사이의 초음파 처리기 팁은 항상 세척하십시오. 초음파 처리기 팁을 청소하는 것은 단백질 이월을 제한하는 데 중요하다. 초음파 처리기프로브를 비커에 70% 농도의 에탄올 또는 초음파 처리의 에탄올로 닦는 것은 초음파 처리기 팁을 청소하는 효과적인 방법입니다.

Written by Rithika Suresh

Rithika Suresh completed her undergraduate degree in Biotechnology in Anna University before completing her masters in Biotechnology at University College Dublin.