샌드위치 엘리사
그림 1: 샌드위치 ELISA의 개략도, 이에 캡처 항체 및 탐지 항체는 관심의 단백질에 바인딩 한.
샌드위치 ELISA 란 무엇입니까?
Sandwich ELISA (효소 연결 면역 흡착제 분석) 는 연구자가 샘플에서 관심 있는 단백질, 호르몬 또는 분석 물질의 양을 정량화할 수 있는 항체 기반 기술입니다. 포착 및 검출 항체는 단백질의 겹치지 않는 에피토프 (epitopes) 에 결합하여 단백질을 샌드위치합니다. 따라서 이름, 샌드위치 ELISA. 검출 항체를 첨가한 후, ELISA 플레이트 리더기로 판독할 수 있는 비색 신호를 생성하기 위해 화학 기판 (예: TMB) 을 첨가합니다.
Top ELISA Kits
샌드위치 엘리사 항체
샌드위치 ELISA를 생성하는 데 사용되는 항체는 검출되는 특이성, 민감도 및 분석물에 따라 다클론 또는 단클론 항체가 될 수 있습니다.
> 폴리클론 항체
폴리클론 항체는 종종 샘플에서 가능한 한 많은 분석물을 끌어 내리는 데 사용됩니다. 폴리 클론 항체는 에피토페의 여러 측면에 결합 할 수 있으므로 관심있는 단백질을 검출하기위한 증가 된 캡처 기회를 제공합니다.
> 단클론 항체
단일 클론 항체는 연구자들이 단일 항원을 끌어 당길 수있게합니다. 따라서 연구자가 단백질의 미묘한 차이를 구별 할 수있게하십시오. 단일 클론 항체는 또한 폴리 클론 항체에 비해 데이터의 일관성을 증가시킨다.
샌드위치 ELISA의 장점
| 장점 | 설명 |
|
시료 정화 불필요 |
샌드위치 ELISA 분석은 정화 없이 복잡한 샘플에서 단백질/분석물을 측정할 수 있습니다. |
|
높은 특이성 |
포획 및 검출 항체가 사용되기 때문에 샌드위치 ELISA 분석은 직접 또는 간접 ELISA 분석에 비해 민감도가 증가했습니다. |
|
정량화 |
Sandwich ELISA 분석법을 사용하면 Western Blot 같은 다른 EIA 방법과 비교하여 연구원들은 샘플의 단백질 양을 정량화할 수 있습니다. |
샌드위치 엘리사 키트
제약 샌드위치 ELISA 키트
ELISA Genie의 제약 ELISA 키트는 제약 및 생명 공학 연구의 요구를 충족하도록 설계된 고품질 ELISA 키트입니다. ISO 9001:2000 품질 시스템에 따라 검증된 고품질 단클론 항체 쌍과 시약에 초점을 맞춘 PharMagenie ELISA 키트는 우리의 미래를 발견하는 데 도움이 되는 우수한 분석법입니다.
샌드위치 엘리사 비디오
ELISA Genie에서 우리는 인간, 마우스 및 쥐 대상을 포함한 인기 있는 ELISA 키트의 사용을 위한 주요 프로토콜 샌드위치 ELISA 비디오를 개발했습니다. 이 교육용 비디오는 ELISA 프로토콜의 주요 단계에 대해 논의하여 연구자들이 효율적으로 분석할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 ELISA 키트에 따라 약간 다를 수 있습니다.
샌드위치 엘리사 프로토콜
샌드위치 ELISA 분석은 연구자들이 혈청, 혈장, 세포 상위제, 조직 및 기타 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 관심 있는 단백질을 정량화할 수 있도록 도와줍니다. 샌드위치 ELISA 키트는 두 가지 형식으로 구입할 수 있습니다. 사전 코팅된 ELISA 플레이트로 포착 항체가 폴리스티렌 ELISA 플레이트에 코팅되어 있거나 항체 쌍을 구입하여 자신의 ELISA 샌드위치 해법을 개발할 수 있습니다. 아래에서는 두 프로토콜을 모두 설명합니다.
샘플 준비 및 수집
다양한 샘플 유형을 사용하여 Sandwich ELISA로 단백질/분석 물질 수준을 측정할 수 있습니다.
모범 사례에 따르면, 샘플 수집 후 가능한 한 빨리 단백질을 추출하고 실험을 수행하십시오. 또는 지정된 온도 (-20°C/-80°C) 에 추출물을 보관하고 최적의 결과를 얻으려면 반복적인 동결 해동 주기를 피하십시오.
혈청: 혈청 분리기 튜브를 사용하는 경우 시료가 실온에서 30분 동안 응고되도록 하십시오. 1,000x g에서 10 분 동안 원심 분리기. 혈청 분획을 수집하여 즉시 또는 유사하게 분석하여 시료를 -80°C로 보관하고 여러 번의 동결 해동 주기를 피하십시오.
혈청 분리기 튜브를 사용하지 않을 경우 2-8°C에서 시료를 밤새 응고시킬 수 있습니다. 1,000xg에서 10분 동안 원심분리기. 혈청을 제거하고 즉시 또는 알칼리성을 제거하고 시료를 -80°C 에 보관하고 여러 번의 동결 해동 주기를 피하십시오.
플라즈마: EDTA 또는 헤파린을 항응고제로 사용하여 혈장을 수집하십시오. 수집 후 30분 이내에 1000 × g에서 4°C에서 15분 동안 원심 분리 시료. 플라즈마 분획을 수집하여 즉시 또는 유사하게 분석하여 시료를 -80°C로 저장하십시오. 다중 동결 해동 주기를 피하십시오. 참고: 이상 용혈 샘플은 사용하기에 적합하지 않습니다.
다양한 샘플 유형에 대한 자세한 내용은 샘플 수집 가이드를 참조하십시오.
샌드위치 ELISA (사전 코팅) 프로토콜 단계별
그림 3: 미리 코팅 된 ELISA 플레이트에 대한 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다. 첫째, 표준을 준비한 다음 ELISA 플레이트 및 인큐베이트에 샘플을 첨가합니다. 배양되면 플레이트를 씻은 다음 라벨이 붙은 항체 및 인큐베이트를 넣습니다. 배양 후 플레이트를 씻고 SABC 작업 솔루션을 추가하십시오. 플레이트를 씻고 TMB 기판을 넣은 다음 배양기를 넣습니다. 마지막으로 중지 솔루션 및 측정을 추가하십시오.
| 단계 | 절차 |
|
1. |
사전 코팅 플레이트에 표준, 시험 샘플 및 제어 (제로) 우물을 각각 설정한 다음 위치를 기록합니다. 각 표준과 샘플을 중복으로 측정하는 것이 좋습니다. 표준, 시료 및 제어 (제로) 우물을 추가하기 전에 판을 두 번 세척하십시오! |
|
2. |
표준 웰에 0.1ml 표준 솔루션을 알리쿼트. |
|
3. |
0.1ml의 시료/표준 희석 버퍼를 제어 (제로) 우물에 추가합니다. |
|
4. |
시험 시료 웰에 적절하게 희석된 샘플 (인간 혈청, 혈장, 조직 균질화 및 기타 생물학적 유체) 0.1ml를 넣으십시오. |
|
5. |
덮개로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 90분 동안 배양합니다. |
|
6. |
커버를 제거하고 플레이트 내용물을 버리고 흡수성 필터 용지 또는 기타 흡수성 물질에 판을 박수 치십시오. 우물을 언제든지 완전히 말리지 마십시오. 세척 플레이트 x2. |
|
7. |
위의 우물 (표준, 시험 샘플 및 제로 웰) 에 바이오틴 검출 항체 작업 용액 0.1 ml를 추가합니다. 측벽을 건드리지 않고 각 우물의 하단에 솔루션을 추가하십시오. |
|
8. |
덮개로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다. |
|
9. |
덮개를 제거하고 세척 완충기로 3 번 판을 씻으십시오. 각 세척 사이에 1 분 동안 우물에 세척 버퍼 나머지를 보자. |
|
10. |
각 웰에 0.1 ml의 SABC 작업 용액을 넣고 플레이트를 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. |
|
11. |
덮개를 제거하고 세척 판을 5 회 워시 버퍼와 함께, 때마다 워시 버퍼가 우물에 머물러있게 1-2 분. |
|
12. |
각 우물에 90µl의 TMB 기판을 넣고 플레이트를 덮고 15-30분 이내에 어두운 곳에서 37°C에서 배양합니다. (참고: 이 잠복기는 참조 용이며 최종 사용자가 최적 시간을 결정해야 합니다.) 그리고 파란색의 음영은 첫 번째 3-4 개의 우물 (가장 집중된 표준 솔루션 포함) 에서 볼 수 있으며, 다른 우물은 명백한 색을 보이지 않습니다. |
|
13. |
각 우물에 50 µl의 스톱 용액을 넣고 철저히 혼합합니다. 색상이 즉시 노란색으로 바뀝니다. |
|
14. |
정지 용액을 첨가한 직후 마이크로 플레이트 리더기에서 450nm의 O.D. 흡수도를 읽습니다. |
샌드위치 ELISA (개발) 프로토콜 단계별
그림 4: 개발 ELISA 키트 샌드위치 ELISA 프로토콜. 샌드위치 ELISA 애세이에 관련된 단계에 대한 단계별 도식입니다. (Loopi = 100PI)
Coating plate with capture antibody
| 단계 | 절차 |
|
1. |
모든 우물에 100µl의 희석된 포획 항체를 첨가하십시오. |
|
2. |
플라스틱 플레이트 커버로 덮고 밤새 4°C에서 배양하십시오. |
|
3. |
덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오: |
|
4. |
모든 우물에 100µl의 블로킹 버퍼를 추가하십시오. |
|
5. |
플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 2시간 동안 배양하십시오. |
|
6. |
덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오: |
|
7. |
플레이트를 즉시 사용하려면 다음 섹션으로 이동하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 코팅된 플레이트와 차단 플레이트를 보관하려면 각 플레이트를 실온 (18~25°C) 에서 24시간 동안 벤치식 건조시킵니다. 그런 다음 2-8°C에서 건조제를 넣은 밀봉된 비닐 봉지에 최대 12개월 동안 보관하십시오. |
샌드위치 엘리사 프로토콜
| 단계 | 절차 |
|
1. |
표준 곡선을 준비합니다. |
|
2. |
각 표준, 샘플, 제로 (표준 희석 버퍼) 의 100µl을 중복된 적절한 웰에 추가합니다. |
|
3. |
50μl의 희석된 검출 항체를 모든 우물에 첨가하십시오. |
|
4. |
플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 1시간 동안 배양하십시오. |
|
5. |
덮개를 제거하고 다음과 같이 판을 씻으십시오: |
|
6. |
모든 우물에 스트렙타비진 - HRP 용액 100μl을 추가합니다. |
|
7. |
플라스틱 플레이트 커버로 덮고 실온 (18~25°C) 에서 30분 동안 배양하십시오. |
|
8. |
세척 단계를 반복합니다. 5. |
|
9. |
즉시 사용할 수 있는 TMB 기판 솔루션 100μl을 모든 유정에 추가합니다. |
|
10. |
실온에서 5-15 분* 동안 어둠 속에서 부양하십시오. 플레이트를 알루미늄 호일에 싸서 빛에 직접 노출시키지 마십시오. |
|
11. |
모든 우물에 정지 시약 100μl을 추가합니다. |
|
12. |
기본 파장으로 450nm을 사용하고 선택적으로 630nm을 기준 파 길이로 사용하는 분광 광도계에서 각 우물의 흡수율 값 (11단계 직후) 을 읽습니다 (610nm ~ 650nm 허용). |
탐지 및 데이터 분석
말 무 퍼 옥시다제 (HRP) 및 알칼리 포스 파타 아제는 샌드위치 ELISA 방법으로 분석물을 검출하기 위해 가장 널리 사용되는 효소이며 응용 분야에 따라 연구자에게 다양한 옵션을 제공합니다.
P-니트로페닐 인산염
PnPP는 ALP 기판입니다. PnPP를 추가 한 후 실온에서 10-30 분 동안 샘플을 배양하십시오. 0.75M의 NaOH를 추가하고 405nm에서 샘플을 판독하여 반응을 중지합니다.
과산화수소
과산화수소는 HRP의 기질이며 반응 중에 색 변화를 허용합니다.
테트라멜벤지딘 테트라메틸벤지딘
TMB는 HRP의 존재 하에서 과산화수소의 환원에 따라 색 변화를 겪습니다. 반응을 냉각시키기 위해 황산을 첨가하고 반응은 ELISA 플레이트 리더기를 통해 450nm에서 판독할 수 있는 색상 변화를 가져옵니다.
결과 계산하기
다음 방정식을 사용하여 계산합니다.
상대 O.D.450 = (각 우물의 O.D.450) — (제로 우물의 O.D.450)
표준 곡선은 각 표준 솔루션 (Y) 의 상대 O.D.450 대 표준 솔루션의 각 농도 (X) 로 플롯할 수 있습니다. 샘플의 농도는 표준 곡선에서 결정할 수 있습니다. 곡선 전문가 1.3과 같은 전문 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다.
참고: 측정된 시료를 희석한 경우, 희석
하기 전에 농도를 얻기 위해 보간에서 농도에 희석 인자를 곱합니다.