Immunohistochemical Staining, 항체 및 버퍼

Immunohistochemistry(IHC : 면역조직화학)은 조직학과 병리학 실험실에서 널리 사용되는 기술입니다. IHC는 조직에서 단백질과 다른 항원을 시각적으로 검출할 수 있게 하여, 생체 샘플 내에서 비정상적인 세포를 검출하거나 단백질의 특징을 확인할 수 있는 방법을 제공합니다.

IHC는 ELISA나 western blot과 같은 다른 immunoassays(면역측정법)보다 정량적이지 않다고 여겨집니다. 그러나, 온전한 조직(intact tissue)에서 단백질 발현 부위를 확인할 수 있고, 이를 통해 암과 같은 질병의 진행 및 치료 옵션을 평가하기 위한 수단을 제공합니다.

IHC는 사용되는 항체의 특이성(specificity)에 의존적입니다. 고도로 특이적인 항체는 tissue section에서 관심 있는 단백질과의 결합을 보장할 수 있습니다. 항체-항원 상호작용의 시각화는 chromogenic(발색성) 또는 fluorescent(형광) 검출을 사용하여 이루어질 수 있습니다. Chromogenic detection(발색성 검출법)은 효소에 결합되는 항체의 사용에 의존합니다. 이 효소는 기질을 잘라서 원하는 단백질의 위치에색깔을 내는 생성물을 만들어 현미경으로 관찰 할 수 있게 합니다. 이와는 대조적으로, 형광검출법에서는 사용된 항체가 fluorophore(형광단)와 결합해 형광현미경을 이용하여 관찰 할 수 있습니다.

Monoclonal 또는 polychlonal antibody 중 올바른 1차 항체를 선택하는 것이, 성공적이고 특이적인 IHC assay의 핵심인데, 이들은 각각 고유한 장단점을 가지고 있습니다. Monoclonal antibody는 한 동물의 single B-cell clone에서 생성되며, 단일 epitope에 대해 immunoglobin의 homogenous population(균질 집단)을 형성합니다. Polyclonal antibody는 multiple B-cell clone으로부터 유도되어 동일한 항원의 다양한 epitope에 대해 항체의 heterogenous mixture(이종 혼합)을 나타냅니다.

Monoclonal antibody는 확립된 hybridoma cell line로부터 생성된 배치들의 개체가 동일하여standardization(표준화)가 가능하므로, monoclonal antibody이 더 선호됩니다. 또한 monoclonal antibody의 사용은 background staining을 제한하고 다른 단백질과의 교차 반응을 감소시키는 것으로 나타났습니다. Polyclonal antibody의 사용은 항원의 검출 신호를 증가시키는데 도움을 줄 수 있으며, 변성 단백질을 다룰 때 선호되는 선택입니다. Polyclonal antibody는 여러 epitope를 인식할 수 있기 때문에 monoclonal antibody와 비교할 때 fixation(고정) 및 처리 중 사소한 변화에도 더 내성이 있습니다.

IHC에 대한 항체를 선택할 때 종(species) 선택을 고려해야 합니다. Low background을 보장하기 위해, 사용되는 2차 항체는 사용되는 1차 항체의 host species에 대항해야 합니다.

올바른 샘플 준비는 고품질 IHC stain의 필수 구성 요소이며 아래에 설명된 몇 가지 주요 단계를 수반합니다.

IHC 검사의 첫 번째 단계는 샘플 채취입니다. 절제된 조직의 autolysis(자가융해) 및 necrosis(괴사)를 방지하려면 올바른 검체 수집이 중요합니다. IHC 분석을 위한 검체의 품질에 영향을 미치는 요인에는 고정까지의 걸리는 시간과 샘플의 온도가 포함됩니다. 따라서 가능한 빨리 샘플을 고정 용액에 넣는 것이 좋습니다.

고정은 단백질의 기본 아미노산 residue사이의 cross-linking methylene bridges 및 Schiff bases를 통해 샘플 보존, 항원의 고정화 및 subcellular structure의 유지를 보장합니다. 부적절하게 고정된 항원은 더 이상 검출되지 않을 수 있으므로, 최적화된 고정 프로토콜이 권장됩니다.

연구 중인 항원에 따라 다른 고정제(fixation agent)가 사용될 수 있습니다. IHC에 가장 널리 사용되는 고정제는 10% neutral buffered formalin입니다. 다른 고정제로는 막의 고정 및 투과성을 위해 사용될 수 있는 메탄올, 에탄올 및 아세톤이 있습니다. 아래 표에는 조직에서 선택한 항원에 대한 권장 고정 용액이 나와 있습니다.

Embedding은 조직의 형태를 보존하고, 처리 및 분할 과정중에 조직을 지지하기 위한 샘플 준비의 필수 구성 요소입니다. 고정과 마찬가지로 항체의 특정 요구 사항에 따라 다양한 embedding compound가 사용될 수 있습니다. Frozen(냉동) 및 paraffin embedding이 가장 널리 사용되며, 각각 사용되는 항체에 따라 뚜렷한 장단점을 나타냅니다.

Frozen tissue section은 paraffin embedded section에 비해 더 짧은 시간 내에 처리할 수 있습니다. Frozen tissue section은 조직을 액체 질소, isopentane에 담그거나 드라이아이스에 급속동결(snap-frozen)하여 준비합니다. 냉동 샘플은 동결 및 sectioning 후 주로 알코올을 이용한 짧은 고정이 필요합니다. 알코올은 포름알데히드와 달리 epitope를 억제하지(masking) 않으므로, 알코올로 고정된 조직에 antigen retrieval을 수행할 필요가 없습니다.

Frozen tissue section은 세포 내 얼음 결정 형성이 subcellular detail에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 장기간 보관하는 방법으로 권장하지 않습니다. Frozen section의 최장 저장 기간은 -80°C에서 1년내로 권장됩니다.

Fronzen section은 paraffin section보다 두꺼운 경우가 많으므로, 현미경 resolution(해상도)이 낮고 조직 형태 이미지가 좋지 않을 수 있습니다. 동결된 조직이 종종 효소 활성을 유지하기 때문에, 내인성 효소의 활성은 IHC 검출 방법에 영향을 미칠 수 있습니다.

Paraffin embedding은 조직 샘플의 장기 보존을 위한 최선의 옵션입니다. Paraffin section은 일반적으로 microtome을 사용하여 3~5 micron 사이로 절단됩니다.

샘플에 파라핀을 embedding하기 전에, dissection(해부) 직후에 고정액을 사용하여 perfusion(관류) 또는 immersion(침수)를 통해 샘플을 고정시켜야 하며, 이는 일반적으로 4-24시간이 소요됩니다. 너무 오래 고정시킬 경우 항원이 억제될 수 있으므로, 샘플을 24시간 이상 고정하지 않습니다. 고정 시간은 최적화가 필요할 수 있으며, 조직 및 항원에 따라 달라질 수 있습니다.

파라핀은 물과 섞이지 않기 때문에, 파라핀 왁스를 첨가하기 전에 조직 샘플을 건조시켜야 합니다. 샘플을 농도가 첨차 증가되는 알코올에 immersion시켜 탈수할 수 있습니다. 알코올 농도의 점진적인 증가는 세포 손상을 최소화합니다. 알코올에서 탈수가 완료되면, 샘플을 xylene에 넣어 남은 에탄올을 제거합니다.

파라핀은 embedding을 위해 60°C로 가열되고, 밤새 굳혀집니다. 이어서, 조직은 microtome을 사용하여 얇은 section으로 절단될 수 있습니다. 이러한 조직 section은 rehydration 및 IHC 프로토콜이 시작될 때까지 상온에 보관할 수 있습니다.

*일부 항원(예: post-translationally modifed residue이 있는 항원)은 가벼운 알데히드 고정에도 보존될 수 없습니다. 이러한 경우, 조직을 급속동결시켜 cryostat(저온유지장치)에서 section해야 하며, 알코올이나 차가운 아세톤으로 고정될 때까지 -80°C에서 보관되어야 합니다.

샘플 고정과정은 조직 보존을 위해 필요하지만, 관심 epitope를 억제함을써 일차항체와의 결합을 방해할 수 있습니다. 따라서 antigen retrieval은 epitope의 masking(억제)을 역전시키고, epitope-antigen 결합을 복원시키는 기술을 의미합니다. Antigen retrieval은 고정에 의해 유도된 cross-linkage를 끊고 항원을 노출시키는 역할을 합니다.

Antigen retrieval 전에 Paraffin embedded tissue는 xylene과 알코올로deparaffinization(탈파라핀화) 단계를 수행해야 합니다. 탈파라핀화는 일반적으로 xylene으로 2회 세척한 후 100%, 95% 및 70% 에탄올으로 3분간 세척하는 것으로 구성됩니다. Rehydration process를 완료하려면 각 조직절편을 ddHO에서 각 5분 간 2회 세척해야 합니다.

Antigen retrieval에는 두 가지 일반적인 과정이 있습니다.

1. Heat mediated (Heat induced epitope retrieval – HIER)
2. Enzymatic digestion (Proteolytic-induced epitope retrieval - PIER)

HIER는 열을 사용하여 epitope를 마스킹합니다. 열원은 전자레인지, 압력솥, steamer, water bath 또는 autoclave가 될 수 있습니다.

이 방법은 Proteinase K, Trypsin, Pepsin과 같은 효소를 사용하여 epitope에 대한 항체의 결합을 복원합니다. Enzymatic digestion reagent(효소 소화 시약)을 사용할 때는 소화작용이 너무 많이 일어나거나 부족하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 즉, 소화작용 시간을 최적화해야 합니다. PIER는 일부 경우에서 immunoreactivity(면역반응성) 회복 성공률이 낮고, 조직의 형태와 관심 항원을 모두 파괴하는 경우가 있으므로, PIER를 사용할 때는 주의해야 합니다.

*Antigen retrieval 기술은 궁극적으로 조직, 고정 방법, 1차 항체에 따라 달라집니다. Antigen masking은 formalin fixation 중 형성된 교차 결합의 결과로 나타나기 때문에, 냉동 조직은 antigen retrieval 이 필요하지 않습니다.

항체가 단백질을 검출하기 위해 세포 내부에 접근해야 하는 특정 샘플의 경우, permeabilization(투과성 부과)이 필요할 수 있습니다. Epitope가 세포질 영역에 위치할 경우 transmembrane protein을 검출하기 위해 permeabilization이 필요합니다.

Permeabilization은 solvent(용제) 또는 detergent(계면활성제)를 사용합니다. 아세톤, 메탄올 등의 solvent는 paraformaldehyde와 같은 crosslingking agent(가교제) 등으로 고정시킨 후 사용할 수 있습니다. Solvent는 cytoskeletal, viral 및 enzyme antigen에 권장됩니다. Detergent는 일반적으로 샘플에 더 순하며 plasma membrane(세포막)을 용해시키지 않습니다. Triton 또는 Tween 20과 같은 detergent는 세포질 또는 세포막에 있는 antigen이나, 가용성 nuclear antigent에 사용됩니다.

IHC 샘플의 blocking(차단)은 깨끗한 IHC결과를 얻고, 신호 대 잡음 비율을 줄이기 위해 필수적입니다. 부적절한 blocking은 높은 수준의 배경 노이즈를 발생시키는 반면, over-blocking은 염색결과를 억제 할 수 있습니다.

Blocking은 샘플이 고정, embedded, antigen retrieval 및 permeabilization된 후, 필요한 경우 1차 항체와 함께 incubation하기 전에 수행되는 전처리의 마지막 단계입니다. Blocking 시간은 샘플에 따라 30분에서 overnight까지 다양합니다. Blocking은 4°C 또는 실온에서 수행할 수 있습니다. IHC 분석에서 관심 epitope 또는 항체에 특별히 결합하지 않는 단백질을 사용하여 blocking합니다.

가장 일반적으로 사용되는 blocking 방법은 다음과 같습니다.

Normal sera(정상 혈청)의 사용은 가장 효과적인 blocking agent 중 하나로 생각되며, 2차 항체가 생성된 종 (host)과 동일한 종의 nomal(unchallenged) sera을 사용하여 수행됩니다. Normal sera의 항체는 샘플의 비특이적 epitope와 결합하여, unconjugated antibody(비결합 항체)가 epitope에 결합하는 것을 방지합니다. Normal sera은 polyclonal antibody를 사용할 때 이상적인 blocking agent입니다.

샘플을 block하기 위해 혈청 대신 protein buffer를 사용할 수 있습니다. Protein buffer는 비특이적 epitope와 결합하기 위해 항체와 경쟁하므로, 고농도의 protein competitor의 사용은 항체와의 경쟁애서 이기고, 궁극적으로 백그라운드 염색을 낮출 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 protein blocking buffer에는 bovine serum albumin(BSA), 젤라틴, 무지방건조우유가 있습니다.

시중에 판매되고 있는 blocking buffers 또한 사용 가능합니다.

Avidin-biotin 검출 시스템을 사용하는 경우, 2차 항체를 첨가하기 전에 내인성 biotin을 block하는 것이 좋습니다.

HRP 결합 항체를 사용하는 경우, 조직에 이미 존재하는 내인성 peroxidase의 활성으로 인해 비특이적 염색이 발생할 수 있습니다. Peroxidase가 있을 때 갈색으로 변하는 DAB substrate와 함께 샘플을 배양하여 샘플에 peroxidase가 존재하는지 확인할 수 있습니다. Peroxidase를 block하기 위해 H202가 일반적으로 사용됩니다.

내인성 alkaline phosphate(AP)은 AP chromogen substrate을 사용할 때 높은 background을 생성할 수 있습니다. 내인성 AP는 일반적으로 신장, 장, osteoblast(골아세포), 림프 및 태반 조직에서 발견됩다. 조직에 내인성 AP가 존재하는지 BCIP/NBT와 함께 incubation하여 확인할 수 있는데, 파란색이 관찰될 경우 내인성 AP가 존재하며 blocking이 필요함을 의미합니다. 내인성 AP는 chromogen substrate에 levamisole을 포함시킴으로써 blocking 할 수 있습니다.

* 모든 blocking agent및 버퍼가 모든 검출 방법과 호환되는 것은 아닙니다. 예를 들어, alkaline phosphatase conjugate는 버퍼에 있는 sodium azide 보존제를 사용할 수 없으며, avidin-biotin complex system은 무지방건조우유를 사용할 수 없습니다.

성공적인 샘플 준비 후, 조직은 표적 항원의 탐지를 위해 선택된 항체와 함께 배양될 수 있습니다.

직접, 간접 및 신호 증폭을 이용하는 간접 방법과 같은 여러 가지 라벨링 기법을 사용할 수 있습니다.

Direct labelling(직접 라벨링)은1차 항체에 신호원을 직접 결합시켜 사용하는 반면, indirect labelling(간접 라벨링)은 항원과 접촉하는 1차 항체에 부착되는 2차 항체가 신호를 생성합니다. 라벨이 1차 항체에 직접 공유 결합을 통해 부착되기 때문에, 직접 검출은 간접 검출보다 빠르고 간단합니다. 이는 배양 단계와 세척 단계가 각 한 번만 필요하다는 것을 의미합니다.

Mouse부터 생성된 1차 항체는, 2차 항체를 anti-mouse와 검출 probe이 결합되어 있는 제품을 사용하여 검출된다는 점에 유의해야 합니다. 마지막으로 신호 증폭 기술을 사용한 간접 방법은 biotinylated secondary antibody와 streptavidin과 같은 증폭 시약을 사용합니다.

1차 항체를 선택할 때는 선택 항원에 대한 특이성과 IHC에 대한 적합성을 고려합니다. Western blot 또는 ELISA assay를 위해 설계된 항체는 고정된 조직에서 교차결합된 표적 항원에 항상 작용하지는 않을 수 있습니다. 따라서 commercial antibody 제품설명서에서 IHC의 예를 확인하는 것이 가장 중요합니다.

1차 항체는 기원된 숙주(host origin)가 다르고 다른 2차 항체로 검출될 경우, 하나의 배양액에서 여러 표적에 사용될 수 있습니다.

2차 항체는 1차 항체에 대한 특이성에 기초하여 선택되어야 합니다. 예를 들어, 토끼에서 만들어진 1차 항체는 토끼에 대한 2차 항체, 즉 anti-rabbit이어야 합니다. 여러 항원은 기원된 숙주에 따라 1차 항체를 구별하는 대조적인 fluorophore(형광체)와 연결된 2차 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 2차 항체 배양은 flourophore를 보호하기 위해 어둠 속에서 이루어져야 합니다.

2차 항체의 isotype이 1차 항체와 일치하는지 여부도 중요합니다. Affinity purified antibody는 비특이적 결합이 가장 낮게 나타나기 때문에 널리 사용됩니다. 하지만 IgG 분획은 잠재적으로 매우 높은 친화력 항체를 포함할 수 있으며, 항원이 잘 발현되지 않거나 낮은 농도로 나타날 때 사용할 수 있다는 점에 주의해야 합니다.

Counterstaining(대조염색)은 관심 항원을 발현하지 않는 샘플의 모든 세포를 식별하는 데 사용될 수 있습니다. Counterstaining은 haematoxylin 또는 DAPI를 사용할 수 있습니다.

슬라이드에 커버 슬라이드를 mount하려면 형광 현미경 검사용으로 지정된 mounting medium를 사용하여 샘플의 형광 신호를 보존합니다. 충분한 mounting medium을 커버슬립에 도포하고, 이미지를 왜곡하거나 흐리게 할 수 있는 거품을 제거합니다.

IHC는 다른 모든 assay와 마찬가지로 staining 패턴이 정확하고 신뢰할 수 있는지 확인하기 위한 control(대조군)이 필요합니다. IHC의 경우 antigen control과 reagent control이 모두 권장됩니다.

Antigen Control – Positive antigen control과 negative antige control이 모두 있어야 합니다. Positive control(양성 대조군)은 연구 중인 단백질을 발현하는 것으로 알려진 조직을 이용할 수 있습니다. Negative control(음성 대조군)은 관심있는 단백질을 발현하지 않는 것으로 알려진 조직을 이용합니다. Negative control을 사용하면 비특이적 결합 및 false positive(위양성)을 식별하는 데 도움이 됩니다.

Reagent Control – Reagent control는 검출 시스템이나 검체가 아닌, 항원을 staining한 1차 항체에서 staining이 생성된다는 것을 확인하기 위해 사용됩니다. 이는 1차 항체를 사용하지 않고 diluent(희석제)만 이용한 검출 시스템을 통해 확인할 수 있습니다.

각 실험마다, 1차 항체의 class와 type이 일치하는(일차 항체가 monoclonal antibody인 경우) non-specific isotype control antibody와 함께 배양한 tissue section을 포함하는 것이 좋습니다. Isotype control은 표적 항원의 특이적 형광 라벨링과 비특이적 배경 형광을 구별하는 데 도움이 됩니다. 1차 항체가 polyclonal antibody인 경우, non-specific, species-matched polyclonal antibody와 함께 배양된 tissue section을 포함시킵니다.

*가열 후 식힙니다. 사용 직전에 아주 차가운 acetic acid 5ml를 첨가합니다. Zenker Solution에 고정된 조직을 다룰 때는 금속 forceps(겸자)를 사용하지 마십시오. 비장 및 결합 조직과 같은 혈액이 많은 검체에 이상적으로 사용됩니다.

*가열 후 식힙니다. 사용 직전에 formaldehyde 5ml를 첨가합니다. 골수, 간, 비장과 같은 혈액 생성 기관에 사용됩니다.

*Soft tissue의 구조를 보존하는데 이상적입니다.

*DNA 및 RNA 고정에 이용됩니다.

1. 0.1M Tris Buffer(pH 7.4)를 만듭니다.

2. Zinc Fixative를 준비합니다.

* 잘 용해되도록 혼합합니다. 최종 pH가 6.5-7.0이 되도록 조정합니다. Fixative reagnet는 실온에 보관합니다.

1. pH 7.4인 0.2M Phosphate Buffer(PBS)를 만듭니다.

2. 이것으로부터 0.1M Phosphate Buffer(pH 7.4)를 만듭니다.

3. 4% Paraformaldehyde in 0.1M Phosphate Buffer를 만듭니다.

* 용액을 저어주면서 60-65℃까지 가열합니다. 1N NaOH를 용액이 투명해질때까지 몇방울 가합니다. 용액이 용해될때까지 계속 저어줍니다. 식힌 후 필터로 걸러줍니다.

* 10% formalin은 실제로37-40% stock solution의 10%에 해당합니다. 그러므로, 10% formalin에 용해된 실제 formaldehyde의 양은 단 3.7-4.0% 입니다.

Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodiem Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)

* 1N HCL을 이용하여 pH를 6.0으로 맞춥니다. 실온에서 3개월까지 보관 가능하며, 장기간 보관하기 위해서는 4℃에 보관합니다.

* NaOH로 pH를 8.0으로 맞춥니다. 실온에서 3개월까지 보관가능합니다.

*pH를 9.0으로 맞춥니다. 실온에서 3개월까지 보관 가능하며, 장기간 보관을 위해서는 4℃에 보관합니다.

1. Trypsin stock solution(0.05%)를 만듭니다.

* -20℃에 보관합니다.

2. 1% Calcium Chloride Stock Solution를 만듭니다.

* 4℃에 보관합니다.

3. Trypsin working solution (0.05%)

*NaOH을 이용해 pH7.8로 맞춥니다. 4℃에서 한달간 보관 가능하며, 장기간 보관시 -20℃에 보관합니다.

Tripton 또는 NP-40

PBS에서 0.1-0.2%를 10분간만 사용합니다.

*Nuclear antigen staining에서 핵막을 부분적으로 용해시킬 수 있습니다.

Tween 20, Saponin, Digionin 및 Leucoperm

0.2-0.5%를 10-30분간 사용합니다.

* cytoplasmic antigen 및 soluble nuclear antigen에 적합합니다.

Peroxidase Blocking Solution (3% H202 in PBS)

* 4℃에서 3개월까지 보관가능합니다. Paraffin section에 추천되는 solution입니다.

Peroxidase Blocking Soluiton (0.3% H2O2 in Methanol)

* 4℃에 보관합니다. Frozen section에 추천됩니다.

Biotin 0.001% in PBS.

* 4℃ 보관

Normal Rabbit Sera blocking buffer

* 4℃ 보관

* 4℃ 보관. Sodium azide는 HRP의 inhibitor이므로, HRP conjugated antibody를 희석하는데 사용하지 않습니다.

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