ELISA 분석은 연구자가 샘플에 존재하는 분석물의 양을 결정할 수 있는 항체 기반 실험입니다. ELISA 분석은 면역학, 신경과학 및 암 연구에 주로 사용되며 염증, 성장 요인 및 신호 분자에 초점을 맞춘 다양한 목표를 분석합니다. 주요 목표에는IL6,IL8,BDNF및VEGF가 포함됩니다.

연구자들이 주로 분석물을 측정하는 데 사용되는 ELISA 분석의 두 가지 일반적인 유형은샌드위치 ELISA와경쟁력 있는 ELISA기술입니다. 샌드위치 (항체가 플레이트에 결합됨) 와 경쟁력 있는 (항원은 플레이트에 결합됨) ELISA 분석에는 두 가지 주요 항체 결합 단계가 포함되며, 이는 결합 인자, 결합되지 않은 항체 및 낮은 친화력 결합 복합체를 제거 할 수 있도록 주요 세척 단계로 구분됩니다.

ELISA 실험의 출력을 측정하기 위해 수많은 기판을 사용하여 최종 항체-항원 결합 복합체를 검출할 수 있습니다. 비색계, 화학 광원 및 형광 기반 분석은 세 가지 주요 기술입니다. 일반적으로 ELISA는 시료의 비색계 기반 측정을 말하며, TMB (3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘) 는 말 무 과산화 효소가 존재할 때 과산화수소를 물에 환원시키는 수소 기증자 역할을 합니다. 이 반응은 용액의 색상을 파란색으로 바꾸는 다이민 (diimine) 을 생산합니다. 이 파란색으로 변하는 색상 변화는 370 & 650 nm의 스펙토 포토미터에서 읽을 수 있습니다. 이 반응을 멈추기 위해 황산이 샘플에 첨가되어 황색으로 변합니다. ELISA 플레이트는 분광 광도계를 사용하여 분석되고 450nm에서 판독할 수 있습니다.

ELISA 프로토콜의 핵심 단계는 세척 단계입니다. 세척 단계는 신호 대 잡음의 비율 증가를 초래하는 언 바운드, 공액 항체에 기인 할 수있는 배경 신호를 줄이기 위해 중요하다. 따라서 세척 단계는 항원과 항체 사이에 높은 충실도 결합 상호 작용만 발생하도록 보장합니다. 비효율적인 세척이 발생하면 배경 수준이 높아져 데이터 수집을 방해하고 샘플 간의 변동이 높아져 결과적으로 결과가 좋지 않을 수 있습니다.

ELISA 플레이트에 첨가 된 세척 버퍼의 양은 플레이트의 효과적인 세척을 보장하는 열쇠입니다. ELISA 플레이트 와셔나 멀티 채널 파이펫을 사용하는지 여부에 따라 플레이트를 세척할 때 필요한 용량에 주의하십시오. 세척 버퍼 부피는 각 우물에 첨가 된 코팅 버퍼 부피보다 높아야합니다. 예를 들어, 플레이트가 100µL의 코팅 버퍼로 코팅된 경우 200 - 350µL과 같은 웰의 완전한 세척을 위해 더 많은 양의 세척 버퍼를 추가해야 합니다.

세척량 후, 세척 주기 횟수는 배경의 제거를 증가시키는 동시에 결합 된 항원 분석물의 불필요한 세척을 방지하기 위해 중요합니다. 샘플이 과도하게 세척되면 신호 강도가 감소하고 데이터를 측정하고 분석하기 어려울 수 있습니다. 프로토콜에 당신의 위치에 따라 1-3-5 세척 단계가 필요할 수 있습니다. 일반적으로 프리 코팅 플레이트는 DIY 코팅 플레이트보다 세척 단계가 적지 만 ELISA 플레이트를 읽는 데 사용되는 제조업체 및 기술에 따라 다를 수 있습니다.

ELISA 프로토콜 중 버퍼의 흡인은 잔류 버퍼, 원치 않는 복합체 또는 항체를 제거하는 핵심입니다. 다중 채널 파이펫을 사용할 때는 단계 사이의 다중 채널에 신선한 파이펫 팁을 놓습니다. 완충기를 흡인 할 때 우물의 측면이나 바닥에 닿지 않도록 조심하면서 다중 채널을 우물에 넣으십시오. 완충기를 제거한 후, 판을 뒤집어 종이 타월에 판을 눌러 잔류 완충기를 제거 할 수 있습니다. 세척 단계와 완충 단계 사이에 판을 말리지 마십시오.