Co-Immunoprecipitation(co-IP) 프로토콜
co-IP란 무엇입니까?
Co-immunoprecipitation(면역침강법)은 전체 세포 용해물(cell lysates)로부터 표적 단백질과 그 결합 파트너를 분리하기 위해 수행되는 인기 있는 도구입니다. Lysate은 단백질 특이 항체와 함께 인큐베이션됩니다.
항체/항원 복합체는 protein A/G-coupled agarose beads를 사용하여 샘플에서 추출되며, 이로부터 관심 단백질을 분리시킵니다. 관심 단백질은 원심분리에 의해 agarose beads로부터 분리되고, western blot으로 분석됩니다. 아래에는 Co-immunoprecipitation(Co-IP), buffer 및 solution, 최적화된 프로토콜과 힌트 및 팁 등 완벽한 IP를 수행하는 데 필요한 모든 것이 나와 있습니다.
Co-IP lysis buffers
IP Lysis Buffer
- 50 mM HEPES, pH 7.5
- 150 mM NaCl
- 1 mM EDTA
- 5 mM EGTA
- 1% (w/v) Tween 20,
- 1 mM dithiothreitol
- 1 mM NaF
- 100 µM PMSF
RIPA Buffer
- 1% v/v NP-40
- 20mM Tris-HCL pH 7.4
- 5mM Sodium Pyrophosphate
- 5mM EDTA
- Freshly added proteinase Inhibitors (Leupeptin, PMSF, Sodium Ortovanadate)
Protein A & G agarose beads
Protein G Agarose Beads는 immunoprecipitation(IP assays)로부터 면역 복합체의 소규모 분리를 위한 affinity matrix(친화성 매트릭스)입니다. Protein G는 Agarose Beads에 공유 결합되어 있으며, 이는 IgG 계열 항체를 포함한 다양한 항체에 결합할 수 있게 합니다. 이것은 Protein G Agarose Beads를 protein A 및 G 항체를 포함하는 immunoprecipitation실험에 이상적인 도구로 만들어 줍니다.
Protein G Agarose Beads는 protein A 및 G 항체를 포함한 다양한 immunoprecipitation assay에 사용될 수 있습니다.
Protein G Agarose Beads를 사용의 이점은 다음과 같습니다.
- 사용하기 쉽고 상온에 보관할 수 있습니다.
- 항체에 대한 binding capacity가 높아 소규모 immunoprecipitation 실험에 이상적입니다.
- IgG 계열 항체를 포함하여 다양한 항체와 함께 사용될 수 있습니다.
- protein A 및 G 항체를 포함하는 immunoprecipitation실험을 위한 다목적 도구입니다.
전체 세포 추출물로부터 단백질의 분리를 위한Co-IP(Co-immunoprecipitation) 프로토콜
| 단계 | 과정 |
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1. |
400 x g에서 3분간 원심분리하여 세포를 수확한다. |
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2. |
Media를 흡인하여 제거한다. |
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3. |
IP lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM EGTA, 0.1% (w/v) Tween20, 1 mM dithiothreitol, 1 mM NaF and 100 µM PMSF) 또는 RIPA buffer 500 µl를 이용하여 세포를 재현탁시킨다. 얼음에 15분간 둔다. |
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4. |
세포를 10초 x2회 sonicate하여 바로 얼음에 둔다. |
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5. |
4 °C, 10,000 x g 에서 10분간 원심분리한다. |
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6. |
상등액을 차가운 상태의 새로운 Eppendorf에 옮긴다. |
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7. |
Bradford assay (아래 참조)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다. |
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8. |
A/G sepharose beads 20 µl과 rabbit or mouse IgG control antibody 2 µg이 들어있는 새로운 Eppendorf에 단백질1-2mg을 넣어 전체 세포 추출물을 pre-clear한다. |
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9. |
4 °C에서 샘플을 한시간 동안 회전(rotate)시킨다. |
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10. |
4 °C, 1000 x g 에서 1분간 원심분리하여 IgG bound-A/G sepharose beads의 pellet을 얻는다. |
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11. |
Bead pellet을 버리고, 상등액은 immunoprecipitation을 위해 보관한다. |
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12. |
상등액을rabbit or mouse IgG control antibody (2 µg) 또는 적절한 antibody (2 µg) 와 함께 A/G sepharose beads (40 µl) 또는 A/G sepharose beads를 담고 있느 새로운 Eppendorf tube에 옮긴다. |
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13. |
IP lysis buffer를 이용하여 샘플 부피를 500 µl로 맞춘다. |
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14. |
Immunoprecipitated protein을 얻기 위해, 샘플을 밤새4 °C에서 회전시킨다. |
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15. |
샘플을 4 °C , 1000 x g 에서 1분간 원심분리하여antibody-bound A/G sepharose beads의 pellet을 얻는다. |
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16. |
상등액을 흡인하여 제거한다. |
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17. |
Beads를 IP lysis buffer 또는 RIPA buffer 1ml로 재현탁하여4 °C , 1000 x g 에서 1분간 원심분리한다. |
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18. |
6번 단계를 x3회 수행하여 non-specific protein의 beads을 제거한다. |
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19. |
Bead를 6X Laemmli buffer로 재현탁한다. |
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20. |
100 °C에서 1분간 끓인다. |
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21. |
SDS-PAGE와 Western blotting으로 바로 분석하거나, 분석할때까지 -20 °C에 보관한다. |
Co-Immunoprecipitation을 위한 유용한 팁
Lysate(용해물)의 준비
Co-immunoprecipitation에 사용하는 lysate의 품질에 따라 분석의 성공 여부가 결정됩니다. 올바른 lysis buffer을 사용하면 lysate의 품질을 크게 향상시킬 수 있습니다. 이상적인 lysis buffer는 고유 단백질 구조을 안정화시키고, 효소 활성을 억제하며, 변성(denaturation)을 방지하고, 무엇보다 세포나 조직으로부터 단백질의 최대 방출을 보장해야 합니다. NP-40 및 Triton X-100과 같은 non-ionic detergents는 SDS 및 sodium deoxycholate과 같은 ionic detergents에 비해 덜 강력합니다. Radio-immunoprecipitation(RIPA)와 같은 denaturing buffer의 사용은 nuclear proteins처럼 방출이 어려운 단백질에 이상적입니다.
기계적 균질화 또는 열과 같은 물리적 파괴에 의해 표적 단백질이 세포에서 방출될 수 있는 경우에도 detergent가 없는 buffer가 사용될 수 있습니다. Proteolysis(단백질분해), de-phosphorylation(탈인산화), denaturation(변성)이 세포 용해가 일어나자마자 시작될 수 있다는 것을 항상 염두해야 합니다. 이는 샘플을 항상 얼음 또는 4°C에 보관하고, protease 및 phosphatase inhibitor를 lysis buffer에 첨가함으로써 늦출 수 있습니다.
Lysate의 pre-clearing
Co-immunoprecipitation을 시작하기 전에 beaded support (예:magnetic beads)로 용액을 pre-clearing하면 beads 구성 요소에 비특이적으로 결합할 수 있는 반응성 성분을 제거하는 데 도움이 됩니다. 이러한 pre-clearing 단계는capture antibody(포획 항체)와 동일한 종에서 기원한 isotype의 비특이적 항체를 사용하여 수행될 수 도 있습니다. 이 과정은 co-immunoprecipitation 동안 포획 항체에 비특이적으로 결합할 수 있는 모든 것을 제거할 것입니다. 최종 결과는 background를 낮추고 신호 대 잡음비(signal-to noise ratio)가 향상될 것입니다.
항체의 선택
정화(purification)를 위한 올바른 항체의 선택은 단백질 획득량을 변화시킬 수 있기 때문에 매우 중요합니다. Polyclonal antibody는 표적 단백질에 여러 epitopes를 결합할 수 있고, 더 높은 유지율(retention rate)로 더 단단하게 결합하는 면역 복합체를 형성할 수 있기 때문에 표적 단백질의 결합에 이상적입니다. 검출과정에서polyclonal capture antibody와 monoclonal antibody의 조합은 높은 검출 특이성(detection specificity)와 최대 포획 효율(capture efficacy)을 보장합니다. 또한 IP 샘플의 western blot 검출에 1차 항체의 heavy-chain과 light-chain을 인식하는 2차 항체를 사용하면, 항상 2개의 band(50kDa의 heavy-chain, 25kDa의 light-chain)가 발생한다는 점에 유의해야 합니다
Wash Buffer 의 선택
Co-immunoprecipitation assay에 사용되는 wash buffer는 비특이적 단백질 결합을 줄이고 원하는 단백질 상호작용을 유지해야 합니다. PBS와 TBS는 생리적 농도의 염분과 pH를 가지고 있기 때문에 일반적으로 wash buffer로 사용됩니다. Wash buffer의 염분 농도에 대한 적당한 조정은 경우에 따라 background을 줄이는 데 사용될 수 있습니다.
상기 wash buffer을 사용하여 비특이적 상호작용이 감지될 경우, 염화나트륨 농도를 증가시켜 강도(stringency)를 높일 수 있습니다. 환원제(reducing agents; 1-2 mM DTT 또는 β-mercaptoethanol) 레벨이 낮으면 비특이적 상호작용을 방해하는데 도움이 될 수 있습니다.
Elution(용출) Buffer의 선택
Elution buffer의 강도와 pH는 목표 단백질의 정확한 용출을 보장합니다. Immunoprecipitated sample을SDS-PAGE 또는 Western Blot 으로 분석될 예정이라면, running buffer로 용출하는 것이 이상적입니다. Milder buffer(0.1 M glycine, pH 2.5)에 용출하고, SDS-PAGE gel에 로딩하기 전에 중화시키는 것도 선택지 중 하나 입니다.
단백질 측정을 위한 Bradford Assay
| 단계 | 과정 |
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1. |
96 well plate의 다른well에 각 단백질 샘플을 분주(2ml)한다. |
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2. |
Bradford reagent (100ml)를 각 샘플에 가한다. 거품이 생기지 않도록 주의한다. |
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3. |
실온에서 5분간 조심스럽게 흔들어 준다. |
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4. |
다음 방법으로 얻은 BSA standard curve로 부터 각 샘플의 단백질 농도를 계산한다: BSA의 serial dilution (2mg/ml 에서 15mg/ml 사이)을 준비하여 96well plate의 Bradford reagent 100ml에 가한다. |
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5. |
595nm에서 흡광도를 측정한다. Pro-Max5 microplate reader에서 blank(2ml lysis buffer, 100ml dyd reagent)에 대해 450nm 에서 reference measurement로 normalise 한다. |
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6. |
단백질 샘플 농도를 standard curve로부터 계산할 수 있다. |
Immunoprecipitation Cross-Linking
UV cross-linking and immunoprecipitation(CLIP)는 RNA와의 단백질 상호 작용을 연구하거나 RNA 변형을 식별하기 위해 분자 생물학에서 사용되는 두 가지 기술입니다. Cross-linking은 단백질과 RNA가 공유결합 할 수 있게 하는 반면, immunoprecipitation은 항체를 사용하여 관심 단백질을 끌어내립니다. 이 방법은 mRNA, lncRNA 및 circRNA를 포함한 다양한 유형의 RNA와 함께 사용될 수 있습니다.
CLIP에는 다음과 같은 여러 가지 종류가 있습니다.
- Crosslinking 과Immunoprecipitation of RNA-Binding Proteins (CLIP-seq): 이 방법은 단백질을 immunoprecipitation시킨 다음 co-immunoprecipitated RNA를 sequencing 하여, 단백질의 RNA binding site를 연구하는 데 사용됩니다.
- Crosslinking and Immunoprecipitation of Modified RNAs (CLIP-seq): 이 방법은 modifided RNA를 immunoprecipitation시킨 다음 co-immunoprecipitated RNA를 배열함으로써, m6A와 같은 RNA modification을 연구하는 데 사용됩니다.
- Crosslinking and Immunoprecipitation of Native RNAs (CLIP-NAT): 이 방법은 단백질을 immunoprecipitation시킨 다음, co-immunoprecipitated RNA를 sequencing하여, native RNA-protein interaction을 연구하는 데 사용됩니다.
CLIP은 RNA-protein interaction 및 RNA modification을 연구하는 데 사용될 수 있는 강력한 도구입니다. 이 방법은 새로운 RNA binding protein을 식별하고, RNA 결합 단백질의 결합 부위를 mapping하고, RNA modification을 연구하기 위해 사용되고 있습니다.