Cell Culture Guide - Techniques and Protocols(세포 배양 가이드 – 테크닉과 프로토콜)

세포 배양(cell culture)은 세포 및 분자 생물학에서 사용되는 핵심 도구로서, 세포의 생리학 및 생화학 모델링을 가능하게 합니다. 게다가, 세포 배양으로 연구자들은 약물과 독성 화합물이 세포 반응에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

이 페이지는 포유류 세포 조직 배양 테크닉에 대한 가이드입니다. 포유류 cell line(세포주)의 유지, 분열 및 cryopreservation(냉동 보존)에 관한 다양한 정보를 담고 있습니다. 모든 세포 배양 작업은 무균 조작법(asceptic techniques)을 사용하여 laminal flow hood(클린벤치)에서 수행되어야 한다는 점을 유의해야 합니다.

세포 배양은clonal cells(단세포주)를 사용함으로써 결과의 일관성과 재현성을 얻을 수 있어, 오늘날 연구에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다.

알맞은 환경에서 동물이나 식물 세포를 성장시키는 것을 세포 배양이라고 합니다. 세포마다 최적의 성장을 위해 필요한 배양 요건이 다르며, medium(배지)의 선택과 supplementation(성분추가)를 통해 적절한 요건을 맞출 수 있습니다. 사용되는 배지는 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄), 성장인자(growth factors), 호르몬, 기체(O2, CO2)를 공급하고 생리화학적 환경(pH, 삼투압, 온도)을 조절합니다.

Primary culture(초대 배양)란 tissue isolation (조직 분리) 후 직접 배양된 세포를 말합니다. 일단 이 세포들이 confluent(세포가 플라스크의 모든 가용 공간을 차지함)하게 되면, 세포의 지속적인 성장과 증가를 위한 더 많은 공간을 제공하기 위해 passage 또는 split(분리)을 통해 새로운 용기로 옮겨주어야 합니다. 첫번째 passaged 후, primary culture는 cell line(세포주)라고 불립니다. Primary culture에서 유래한 cell lines은 제한된 수명을 가지고 있는데, 이것은 세포가 노화되기 전에 제한된 횟수만 분열할 수 있다는 것을 의미합니다.

이 세포는 가장 높은 성장 용량을 가진 passaged cell (통과세포) 이기 때문에, 유전자형(genotype)과 표현형(phenotype)의 균일성을 나타냅니다.

Immortal cell line(불멸세포주)은senescence(노화)와 같은 문제를 회피하기 위해 세포 및 분자생물학에서 널리 사용됩니다. 세포는 자연발생적, 화학적, 또는 바이러스에 의한 방법 등 여러 방법을 통해 변형되고 immortalized(불멸화) 될 수 있습니다. 일단 변형되면 이 세포들은 무한히 분열하여 지속적인 cell line이 될 수 있는 능력을 얻습니다.

Cell line들은 다음 중 하나일 수 있습니다.

1. Adherent (Anchorage dependent(부착의존성)) – Adherent cells(부착성 세포)는 고체 또는 반고체 기질(substrate)에 부착된 상태에서 배양해야 하며, 종종 subculture(계대배양)을 위해 trypsinization(트립신화)가 필요합니다. (자세한 내용은 2.6 참조)

2. Suspension (Amchorage Independent(부착비의존성)) – Suspension cells(부유형 세포)는 고체 성장 기질을 필요로 하지 않으며, culture medium에서 부유한 상태로 성장할 수 있습니다.

아래는 cell lines 배양에 대한 일반적인 가이드라인입니다. 모든 세포 배양 작업은 무균 조작법을 사용하여 microbiological safety cabinet에서 수행되어야 하며, 보호복을 전체적으로 착용해야 합니다.

무균 조작법(aseptic technique)은 무균 환경을 조성하고, 미생물과 멸균상태의 세포 배양 후드 사이에 장벽 역할을 하도록 설계되었습니다. 멸균된 시약과 media를 사용하는 것이 중요합니다. 멸균 조작법에서는70% 에탄올을 뿌리지 않은 물체는 어떤 것도 후드에 들어 들어가지 않는 것을 원칙으로 합니다.

세포 배양 후드는 무균 작업 공간을 제공하는 동시에, 미생물학적 과정에서 생성된 감염성 방울 및 에어로졸의 차단을 보장합니다. Class I, II, III로 분류된 세 가지 종류의 세포 배양 후드가 있으며, 이들은 다양한 연구 및 생물학적 안전 요구를 충족하기 위해 개발되었습니다. 실험자의 실험적 필요에 맞는 장비를 선택해야 합니다.

시작하기 전에, 원하는 cell line에 적합한 media 종류 및 culture supplement를 사용하는지 확인합니다. 이는 항상 멸균 상태여야 하며, 후드 내부에서만 개봉해야 합니다. 대부분의 cell line은 10% Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM glutamine 및 항생제를 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) culture media 또는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) culture media를 사용하여 배양할 수 있습니다.

특정 endothelial cell line은 성장하기 위해 특별한 collagen matrix를 필요로 합니다. 이러한 매트릭스는 cell line의 attachment(부착), differentiation(분화) 및 성장을 보장합니다. 세포 배양 실험을 시작하기 전에, 관심있는 cell line에 대한 문헌 검토를 수행하여 매트릭스와 같은 추가 성장 요건이 충족되는지 확인하는 것이 중요합니다. 사용 중인 플라스크의 종류(예: vented 또는 non-vented)에 유의합니다. Non-vented/plug플라스크를 사용할 경우, 가스 교환이 가능하도록 캡을 느슨하게 해야합니다. Vented플라스크를 사용할 경우, 가스교환 효율에 영향을 미치므로 필터가 젖지 않도록 유의합니다.

세포는 현미경으로 매일 검사하여 건강하고 예상대로 자라고 있는지 확인합니다. 현미경에서 건강한 세포가 어떻게 보이는지 익히는 것이 중요한데, 이는 형태 변화를 통해 성장이 정지되었거나 감염된 세포를 더 쉽게 감지할 수 있기 때문입니다.

포유류 세포는 플라스크의 70-80%가 세포로 덮여 confluence에 도달하면 split/passage되어야 합니다. Adherent cell의 confluence은 현미경으로 관찰하여 세포 성장을 위한 가시적인 공간이 없는 것으로 확인 할 수 있습니다 Suspension cell(부유형 세포)의 경우, 플라스크를 돌려보았을 때 세포가 뭉치고medium이 탁해 보일 때 confluence를 확인 할 수 있습니다.

세포가 over confluent되지 않도록 하는 것이 중요하며, 70-80% confluency가 가장 이상적입니다. 이 지점을 넘어서면, contact inhibition(접촉 저해)이 나타나고 re-seeding후 회복기간이 더 길어집니다. Cell line의 성장 속도에 따라 사용되는 split ratio가 결정됩니다. 예를 들어, 천천히 성장하는 cell line은 높은 비율로 split하는 것은 바람직하지 않습니다.

빠르게 성장하는 cell line은 느리게 성장하는 cell line에 비해 confluency에 빨리 도달하기 때문에 높은 split ratio가 필요할 수 있습니다. 일반적으로 세포는 1:10 이상 split하면 안되는데, 이는 세포가 생존하기에 너무 낮은 비율이기 때문입니다. Culture의 seeding density를 조절하여 특정 날짜에 실험할 준비가 되도록 조절할 수 있습니다.

일반적으로, confluent cell이 있는 플라스크를 1:2 split 하면, 1-2일 후에 실험에 적합한 70-80% confluent상태가 됩니다. 1:5 split 은 2-4일 후에 실험에 적합한70-80% confluent상태가 됩니다 1:10 split은4-6일 후에 sub-culture 또는 plating에 적합한 70-80% confluent 상태가 됩니다. 단, 이는 cell line의 성장 속도에 따라 달라질 수 있습니다.

* Trypsinization은 일부 세포에 해로울 수 있다. 또한 일부 membrane protein(막단백질)의 일시적인 internalization를 유도할 수 있으며, 이는 실험을 설계할 때 고려되어야 한다. 이러한 경우, gentle cell scraping 또는 detergent 등 다른 방법이 대안으로 사용될 수 있다.

만약 세포를 며칠 동안 배양시켰지만 split할 만큼 충분히 confluent되지 않는다면, 영양소를 보충하고 pH를 유지하기 위해 media를 바꿔야 할 것입니다.

Passage number는 세포가 겪은 sub-culture 의 횟수를 말합니다. Passage number를 기록해야 하며, 그 횟수가 너무 높아지면 안됩니다. Passage number가 30을 초과하는 cell line은 낮은 passage cell에 비해 유전적 이상이 나타날 가능성이 더 높습니다(Esquenet et al., 1997; Line et al., 2003; O'Driscoll et al., 2006).

P30은 세포배양에서 일반적으로 passage number의 상한선으로 여겨지는데, 이는 추가 배양으로 인해 molecular 프로파일이 상당히 변화하여 in vivo 적용성 및 재현성을 제한할 수 있기 때문입니다(Calles et al., 2006; O'Driscoll et al., 2006; Wanger et al., 2004).

Cell line을 동결하는 것은 세포 배양에 필수적인 요소인데, cell line을 교체하는 것이 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리기 때문입니다. 또한 세포가 감염되었을 때, 비축된 재고를 가지고 다시 실험을 시작할 수 있도록 보장합니다. 잉여 세포가 생기는 대로, 유전적 변이(genetic drift)를 제한하기 위해 가급적이면 낮은 passage number의 세포를 seed stocks으로 동결시켜야 합니다. 그런 다음 Seed stock에서 working stock를 준비 할 수 있습니다. 가장 좋고 널리 사용되는 동결세포 보존 방법은media에 DMSO(dimethylsulfoxide)와 같은 cryoprotective agent를 넣어 액체 질소에 세포를 저장하는 것입니다. DMSO와 같은 cryoprotective agent는 media의 어는점을 낮추고 냉각속도를 저하시켜, 세포사 및 손상을 일으키는 것으로 알려진 얼음 결정 형성의 위험을 크게 감소시킵니다

*배양된 세포를 가능한 낮은 passage number에서 고농도로 동결한다. 세포를 냉동하기 전에 최소한 90%의 세포가 생존할 수 있는지 확인한다. 동결 세포를 보관할 때는 항상 멸균된 cryovials을 사용한다. 항상 적절한 무균 조작법을 사용하고 laminar flow hood에서 작업한다.

안전 참고 사항: DMSO는 organic material이 조직으로 유입되는 것을 촉진한다고 알려져 있으므로, 사용할 때 주의를 기울여야 한다. 이 시약을 취급할 때는 장갑을 끼고 적절한 보호복을 착용한다. 시약은 현지 규정을 준수하여 폐기한다.

해동 과정(thawing)은 동결 세포에 매우 큰 스트레스를 줍니다. 천천히 진행 해야하는 동결과정과 달리, 해동 과정은 세포의 높은 생존율을 보장하기 위해 가능한 한 빠르게 진행해야 합니다.

세포 배양 실험실에서 가장 흔한 오염물질 중 하나는 mycoplasma(마이코플라스마)입니다.Mycoplasma는 세포벽이 없는 기본적인 박테리아로, 가장 작은self-replicating organism(자기증식하는 생물)로 간주됩니다.. Mycoplasma는 크기가 약 1 마이크로미터보다 작기 때문에 발견하기 매우 어렵고, 매우 높은 밀도에 도달하여 세포 배양을 악화시킬 때까지 발견하기 어렵습니다.

느리게 성장하는 많은 mycoplasma는 세포사를 유발하지 않고 발견되지 않은 상태로 있을 수 있지만, culture에서 host cell(숙주 세포)의 행동과 대사과정을 변화시킬 수 있습니다. 만성 mycoplasa 감염은cell proliferation(세포 증식률) 감소, 포화 밀도 감소, suspension culture에서 응집 등을 초래할 수 있습니다. 이러한 mycoplasma감염을 탐지하는 유일한 방법은 형광 염색(예: Hoechest), ELISA, PCR, immunostaining, autoradiography 또는 microbiological assays를 사용하여 세포 배양을 주기적으로 검사하는 것입니다.

세포 배양에서 항생제는 최소한 사용해야 합니다. . 항생제의 지속적인 사용은 항생제 내성을 촉진하고, 낮은 수준의 오염의 지속시키며, 다양한 오염물질이 가려지는 것을 가능하게 합니다. 또한, 일부 항생제는 세포와 교차 반응하여 조사 중인 cellular process에 영향을 줄 수 있습니다.

세포 배양 실험실은 연구기관, 조사분야에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그러나 모든 세포 배양 실험실은 몇 가지 필수적인 공통 장비와 요구 사항을 가지는데, 그 중 가장 중요한 것은 병원균이 없는 무균 환경의 유지입니다. 아래는 세포 배양 실험실에서 기대할 수 있는 일반적인 장비와 재료의 목록입니다. 이 목록에는 모든 것들이 포함되어 있지는 않으며, 연구 영역에 따라 차이가 있을 수 있습니다.

세포 배양 실험실은 연구기관, 조사분야에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그러나 모든 세포 배양 실험실은 몇 가지 필수적인 공통 장비와 요구 사항을 가지는데, 그 중 가장 중요한 것은 병원균이 없는 무균 환경의 유지입니다. 아래는 세포 배양 실험실에서 기대할 수 있는 일반적인 장비와 재료의 목록입니다. 이 목록은 모든 것을 포함하는 것은 아니며, 연구 영역에 따라 차이가 있을 수 있습니다.

• 세포 배양 후드 (예: laminar-flow hood 또는 biosafety cabinet)
• 인큐베이터 (humind CO2 인큐베이터 권장)
• Water bath
• 원심분리기
• 냉장고 및 냉동고(–20°C)
• Cell counter (Automated Cell Counter 또는 hemocytometer)
• Inverted microscope
• 액체 질소(N2) 냉동고 또는cryostorage container
• 세포 배양 용기 (예: flasks, Petri dishes, roller bottles, multiwell plates)
• Pipettes and pipettors
• 주사기와 바늘
• 폐기물 용기
• Media, serum및 시약
• 세포