TUNEL 염색 : 세포사 측정을 위한 선택 방법

이 기사에서는 TUNEL 염색 검사에 대해 알아야 할 모든 사항에 대해 설명합니다. 먼저 TUNEL 염색이 무엇인지, 어떻게 작동하는지 설명하겠습니다.

다음으로 사용 가능한 다양한 TUNEL 얼룩 유형에 대해 설명하겠습니다. 그런 다음 TUNEL 염색이 다른 아포토시스 분석에 비해 어떤 장점이 있는지 살펴보도록 하겠습니다.

마지막으로 TUNEL 염색을 올바르게 수행하기 위한 몇 가지 팁을 제공하겠습니다.

TUNEL 검사는 아포토시스 또는 세포사멸의 원리에 기초한다. 세포자살은 세포가 더 이상 기능할 수 없는 상황에서 스스로를 제거하기 위해 스스로를 파괴하는 과정이다. 아포토시스가 일어나기 위해서는 먼저 세포가 DNA 손상을 겪어야 한다. 일단 DNA 손상이 발생하면, 세포는 카스파아제라고 알려진 효소를 활성화시킬 것이다. 카스파아제는 특정 부위에서 DNA를 절단하는 효소군이다. TUNEL 세포 사망 분석은 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소 (terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT)로 알려진 효소를 사용하여 이러한 사실을 이용한다.

TdT는 caspases에 의해 절단된 DNA 가닥의 말단을 인식하고 결합할 수 있다. 일단 TdT가 DNA에 결합하면, 그것은 DNA 가닥의 끝에 뉴클레오타이드의 추가를 촉매할 것이다. 이 과정을 닉 변환이라고 합니다. 뉴클레오타이드의 첨가는 DNA 가닥의 새로운 말단을 생성하며, 이는 형광 염료를 사용하여 검출될 수 있다. 이것이 TUNEL 염색의 원리입니다.

TUNEL 염색을 수행할 때는 셀이 적절하게 고정되고 투과성(permeabilized)이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 같은 고정 용액에서 최소 30분 동안 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다. 그런 다음 염색하기 전에 Triton X-100과 같은 세제로 세포를 투과시켜야 한다. 다음은 TUNEL 검사를 사용하여 세포사멸세포를 검출하는 단계입니다:

- 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 30분간 고정한다

- Permeabilize 트리톤 X-100 포함

- TUNEL 반응 혼합물에서 60분간 배양

- PBS로 헹구고 연장 골드 안티페이드 시약(Prolong Gold Antifade Reagent)과 같은 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 장착합니다.

- 405 nm의 들뜸 파장과 525 nm의 방출 파장을 이용한 형광 현미경으로 보기

두 가지 종류의 TUNEL 얼룩이 있습니다. FITC-dUTP는 민감도가 높고 사용이 편리해 가장 많이 사용되는 염색제로, PI-dUTP는 민감도는 낮지만 광표백에 강하다.

TUNEL 염색을 수행할 때, 세포핵 염색에 대항하기 위해 DAPI와 같은 음성 염색을 사용하는 것이 중요하다. 이렇게 하면 apoptotic 구만 감지되는 데 도움이 됩니다. TUNEL 검사는 세포사멸에 특이적이지 않으며 괴사 세포도 감지한다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 오양성을 피하기 위해서는 staurosporine 처리된 세포와 같은 양성 대조군을 사용하는 것이 중요하다.

스트렙타비딘-비오틴 결합체( Streptavidin-biotin conjugates)는 또한 세포자살세포를 검출하기 위해 dUTP 대신 사용될 수 있다. 이 방법에서, 비오틴-태그 뉴클레오타이드는 TUNEL 반응 혼합물에 사용된다. 스트렙타비딘-비오틴 결합체는 비오틴 태그에 결합하는 데 사용된다. 비오틴-태그 뉴클레오타이드는 분해에 더 강하고 더 강한 신호를 생성한다. 이 방법은 FITC-dUTP나 PI-dUTP를 사용하는 것보다 더 민감하지만, 더 비싸고 널리 사용되지 않는다.

TUNEL 염색을 사용하는 것은 다른 apoptosis assays(apoptosis assay)에 비해 몇 가지 장점이 있다. 첫 번째 장점은 TUNEL 염색이 flow cytometry 또는 immunohistochemistry과 같은 다른 방법과 비교할 때 매우 민감하고 특정하며 사용하기 쉽다는 것이다. 이것은 TUNEL 염색이 세포가 광범위한 DNA 손상을 겪기 전의 초기 단계에서 세포자살을 감지하는 데 사용될 수 있음을 의미한다.

TUNEL 염색의 또 다른 장점은 고정된 세포에 사용할 수 있다는 것이며, 이는 라이브 세포 이미징을 수행할 필요가 없다는 것을 의미한다. 라이브 셀 이미징은 수행하기 어려울 수 있고 종종 값비싼 장비가 필요하기 때문에 이는 상당한 이점이다. 이것은 살아있는 세포에만 사용될 수 있는 Annexin V 분석과 같은 다른 세포사멸 분석보다 중요한 장점이다. 또한, TUNEL 염색은 photobleaching(photo blocking)에 내성이 있으며 다양한 세포 유형에 사용될 수 있다.

마지막으로, TUNEL 염색은 세포의 더 완전한 그림을 만들기 위해 dapi 또는 propidium iodide과 같은 다른 염색과 함께 사용될 수 있다. 이것은 특히 세포자살의 초기 단계를 조사할 때 유용한데, 이는 dapi 또는 propidium oidide만으로는 DNA 손상을 발견하기 어려울 수 있기 때문이다

TUNEL 염색을 수행할 때 주의해야 할 몇 가지 중요한 팁이 있습니다.

첫째, 갓 분리된 세포를 사용하는 것이 중요하다. 이것은 세포 세포가 빨리 분해되고 세포가 신선하지 않으면 감지하기 어려울 수 있기 때문이다. TUNEL 염색을 수행할 때는 신선한 시약을 사용하는 것도 중요합니다. 장기간 보관한 시약은 효과가 없을 수 있으며, 잘못된 음성 결과를 초래할 수 있습니다.

둘째, 희석된 TUNEL 얼룩을 사용하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 셀이 올바르게 염색되고 잘못된 양성 반응이 감지되지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 셋째, 염색 반응을 최소 15분 동안 지속시키는 것이 중요하다. 마지막으로, 묶이지 않은 TUNEL 얼룩을 제거하기 위해 얼룩이 묻은 후 셀을 완전히 세척하는 것이 중요합니다.

최상의 결과를 얻으려면 염색 조건을 최적화해야 합니다. 이를 위해서는 약간의 실험과 시행착오가 필요할 수 있다. 이 블로그에 언급된 팁을 따름으로써 TUNEL 검사가 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하도록 보장할 수 있습니다. 이상으로 TUNEL 염색에 대한 포괄적인 가이드를 마칩니다. 유익하고 도움이 되셨기를 바랍니다!