Hemocytometer 세포 카운팅 및 계산

Hemocytometer(혈구계)는 의료 목적으로 혈액 세포를 정확하게 계산하도록 설계된 기구로, 19세기 초부터 사용되었습니다. 이 기술은 표면 장력에 의한 세포 삽입, 넓이를 기반으로 한 부피 측정, 결과의 통계적 유의성 등 다양한 분야의 개념을 사용합니다.

Hemocytometer 챔버에는 1mm2 구획 9개를 구분하는 선이 세심하게 새겨져 있습니다. (가장 일반적인 hemocytometer의 경우) 각 구획은 동일한 크기의 16개 또는 25개의 작은 정사각형으로 분할됩니다. Counting(계수)할 때, 특수 슬라이드를 챔버 상단에 배치하여 표면과 슬라이드 하단 사이에 0.1mm의 간격을 둡니다. 따라서 1mm2 x 0.1mm = 0.1mm3(1E-4mL)의 부피가 됩니다.

세포가 챔버에 배치되면 1mm2 구획에서 볼 수 있는 모든 세포가 공간을 모두 채우므로, 그 부피가 1E-4 mL임을 알 수 있습니다. 이것이 소규모로 세포 밀도(cells/mL)를 측정하는 방법입니다.

4x1mm2 구획에서 세포를 카운트하여, 각각 31, 25, 40, 33 개를 확인하였습니다. 이는1mm2당 평균 32.25개 입니다. 이 영역은 1E-4 mL 부피에 해당하므로, 1E-4 mL에 32.25개의 셀이 존재하여 322,500개의 세포/mL의 밀도를 생성합니다. 다른 공식은 필요하지 않습니다. 우리는 hemocytometer의 크기를 바탕으로 세포 농도를 추론할 수 있습니다. 이를 일반적인 경우로 확장하면, 세포 밀도 = (카운팅 된 총 세포 수 / 카운팅된 정사각형의 수) / 단일 정사각형의 부피 라는 공식을 얻을 수 있습니다. 이는 수행된 희석과정을 고려하지 않은 수치입니다.

1mm2 정사각형의 경우, 단일 정사각형의 부피는 1E-4였지만, 세포수를 세기 위해 선택한 정사각형의 크기에 따라 그 부피가 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 중앙의 정사각형 안에 있는 작은 정사각형은 적혈구 수를 세는 데 사용됩니다. 이 경우 부피는1E-4 mL/25(1mm2 중앙 정사각형에 25개의 작은 정사각형이 있음)이며, 작은 정사각형의 부피는 4E-6 mL이 됩니다.

Hemocytometer count에서 얻을 수 있는 또 다른 유용한 지표가 있습니다. 바로 viability(생존능)입니다. Viability는 배양된 모든 세포 중 살아있는 세포의 양을 측정하게 해줍니다. 죽은 세포를 염색하지만 살아있는 세포는 염색하지 않는 염료를 counting solution에 첨가하여 측정할 수 있습니다. 이 염료에 염색된 세포 (dead cells)와 염색되지 않은 세포(live cells)는 별도로 기록되고, viability는 살아있는 세포 / 총 세포(%)로 계산됩니다.

세포 밀도는 healthy culture(건강한 배양), subculturing(계대 배양), 세포 은행 생성, flow-cytometry 및 ELISA를 위한 샘플 준비 및 publication을 위해 숫자를 추적하는 데 매우 중요합니다. 제 경우에는, 제 모델이 만든 세포 성장 예측과 배양균에서 관찰된 실제 세포 성장을 일치시키기 위해 hemocytometer를 사용했습니다. 한편, viability은 본질적으로 culture health의 지표입니다. 세포독성 물질이 주어진 특정 기간 동안 얼마나 많은 세포를 죽이는지 이해하는 것은 독성 테스트에서도 유용합니다.

Hemocytometer의 사용은 다른 분야로도 확장되었습니다. 발효 중 효모의 밀도와 품질을 평가하기 위해 사용되며, 꿀 생산과정에서 최종 생성물의 꽃가루 농도를 결정할 때도 이용됩니다. 또, 이 기술은hemocytometer를 발전시켜 일회용 챔버로 자동 셀 카운팅을 가능하게 하여, 거의 즉각적인 결과를 제공합니다. 이 새로운 접근 방식은 광범위한 common cell lines에서 상당히 잘 작동하지만(많은 시간을 절약 할 수 있습니다!), 희귀 질환을 가진 환자 세포와 같은 custom application(맞춤형 적용)을 위해 미세 조정이 필요할 수 있습니다.

Hemocytometer를 사용한 세포 카운팅은 매우 반복적이고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 특히 하루에 10-20개의 샘플을 검사해야 할 때는, viable cell을 카운트 하고 모든 샘플에 대한 계산을 급하게 수행해야 합니다. 그것이 바로 제가 생물학 실험실에서 처음 박사학위를 받았을 때 직면했던 문제입니다.

저도 처음에는 다른 사람들처럼 훈련을 받았고, 하루에 10-20번씩 열심히 수작업을 했습니다. 하지만 세포들을 관리하는 것보다, 실험실에서 계산을 하는 데 더 많은 시간을 보내는 시점에 이르렀습니다. 저는 더 나은 방법이 있어야 한다고 생각했습니다. 그래서 제 공학적 기술을 활용하여 HemocyTap이라는 앱을 개발했습니다. 세포 카운트를 기록하고 매일 자동으로 계산을 수행할 수 있도록 말이죠. 제가 앱을 사용하기 시작 한 후, 저희 연구실의 다른 사람들도 이를 사용하기 시작했고, 제 연구실 밖의 다른 사람들도 이 앱을 통해 혜택을 누릴 수 있다는 것을 깨달았습니다. 앱스토어에 앱을 올리고 리뷰를 받기 시작했습니다. 같은 시기에, 저는 세포를 카운팅 하는 작업에 대한 많은 혼란이 있었으며, 사람들이 제가 고생했던 것과 똑같은 방식으로 프로토콜과 계산의 이면에 있는 논리를 이해하려고 애쓰고 있다는 것을 깨달았습니다. 온라인에서 이 주제에 대해 자세히 설명하는 자료를 찾을 수 없어서, 저는 hemocytometer.org을 구축했습니다. 이 모든 것이 2013년에 시작되었고, 그 이후로 웹사이트는 많이 성장했습니다. 저는 또한 세포 카운팅과 관련 기술에 대한 관한 수백 개의 질문을 받았습니다. 그러니 이 게시물을 읽은 후 추가 질문이 있다면, 웹사이트에 가서 댓글을 남기세요!

더 많은 세포 카운팅에 관련한 정보를 원하거나 HemocyTap 앱을 다운로드하려면, www.hemocytometer.org 에 방문해 주세요.

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