셀 동기화 방법

G1 체포

이중 티미딘 블록, 혈청 기아, 사이클린 의존성 인산화효소 억제

G2 체포

미소관 억제, 사이클린 의존성 인산화효소 억제

G2/M 체포

RO-3306

M 상

택솔, 노코다졸

1.

G1/S 경계에서 세포를 동기화하기 위해 새로 준비된 티미딘 용액(16 mM)을 완전 배지로 구성하고 0.22 µm 필터 디스크를 사용하여 필터 멸균했다.

2.

세포(1 X 107)는 티미딘(2 mM)이 함유된 60ml 완전 배지에서 175 cm3 세포 배양 플라스크에서 16시간 동안 배양하였다.

3.

그런 다음 세포가 세포 주기에 다시 들어갈 수 있도록 8시간 동안 완전 배지(52.5ml)에서 세포를 다시 매달았다.

4.

셀은 400 x g에서 5분간 원심분리하여 채취한 후 X 2를 완전 배지(10 ml)에서 세척하였다. 세포(1 X 107)를 티미딘(2mM)이 함유된 60ml 완전 배지에서 16시간 동안 배양하여 G1/S 경계에서 세포를 동기화시켰다.

5.

세포 동기화는 흐름 세포 측정법에 의해 확인되었다.

1.

세포(1 x 107)는 노코다졸(100nM)로 18시간 동안 세포를 처리하여 유사분열에서 동기화되었으며 175cm2의 온도에서 37°C에서 배양되었다

2.

셀을 완전 배지 X3로 세척하고 완전 배지로 다시 도금한 후 시료를 0, 30, 60, 120 및 180분 후에 채취하였다.

3.

대조군으로, 한 개의 샘플을 유사분열에서 세포를 유지하기 위해 노코다졸(100nM)이 있는 상태에서 다시 도금했고, 샘플은 방출 후 180분이 걸렸다.

4.

세포는 RIPA buffer에서 용해되었고 전체 세포 추출물이 준비되었다. 샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

1.

K562 세포는 앞서 설명한 바와 같이 이중 티미딘 블록(DTB)에 의해 G1/S 상에서 억제되었다(첫 번째 샘플 프로토콜 참조)

2.

셀은 400 x g에서 5분간 원심분리하여 채취한 후 X 2를 완전 배지(10 ml)에서 세척하였다.

3.

그런 다음 세포(1 x 106/ml)를 완전 배지에 재부유하고 1시간 동안 휴지시켰다.

4.

세포는 DTB 세포를 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 Taxol(1µM) 중 하나로 11시간 동안 처리했다. DTB 세포는 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 키나제 억제제로 2시간 동안 처리한 후 프로테아솜 억제제인 MG-132(10µM)를 BI2536 (10 µM) Roscovitine (20 µM) , RO-3306 (9 µM), Purvalanol A (10 µM)했다

5.

세포는 RIPA 버퍼로 용해되었고 전체 세포 추출물이 준비되었다.

6.

샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

1.

세포(1 x 106)를 차량(0.1%(v/v) DMSO), Taxol(1µM) 또는 Nocodazole(1µM) 중 하나로 12시간 동안 처리했다.

2.

세포는 키나제 억제제인 Roscovitine(20 µM) 또는 Roscovitine과 프로테아솜 억제제인 MG-132(10 µM)로 2시간 동안 처리하였다. 세포는 400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 30 µl RIPA 버퍼로 용해하였다.

3.

샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

1.

K562 세포는 18시간 동안 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 RO-3306(9µM)으로 처리되었다.

2.

셀을 완전 배지에서 세 번 세척하고 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 MG-132(10µM)로 처리된 완전 배지 10ml에 다시 도금했다.

3.

세척 후 0, 15, 30, 45, 60 및 90분에 검체를 채취했습니다.

4.

K562 세포를 RIPA 버퍼로 용해하고 전체 세포 추출물을 준비하였다.

5.

샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

1.

70% 에탄올에 세포를 고정하고 투과시킵니다

2.

요오드화 프로피듐 40µg/ml로 염색하고, 25µg/ml의 RNase를 포함한다(RNA를 분해하고 DNA만 염색하도록 한다).

3.

플로우 세포계에서 샘플을 실행합니다.