셀 동기화 방법

셀 동기화란?

세포 동기화는 배양에서 세포 주기의 다른 단계에 있는 세포들이 동일한 단계로 이동하는 과정이다. 세포 동기화는 세포 주기를 통한 세포의 진행을 연구하는 데 사용된다.

셀은 어떻게 동기화됩니까?

셀은 두 가지 방법으로 동기화 및 분리할 수 있습니다:

1. 화학물질 차단

2. 물리적 분할

1. 화학적 봉쇄

이름에서 알 수 있듯이, 이 방법은 대사 반응을 차단하기 위해 티미딘과 같은 화학 물질을 사용한다. 이것은 주로 세포 주기의 S상 동안 DNA 합성의 억제를 통해 달성될 수 있다. 티미딘, 아미노페린, 하이드록시유레아 및 사이토신 아라비노사이드와 같은 저해제는 다양한 효과를 가질 수 있다. 혈청이 24시간 동안 당신의 세포를 굶기면 G1 단계에서 세포가 축적될 것이다. 혈청 기아의 효과는 세포 동기화가 발생한 후 혈청을 배지에 첨가함으로써 역전될 수 있다.

2. 물리적 분할

물리적 분획 또는 세포 분리 기술은 세포 밀도, 세포 크기, 세포 표면 에피토프에 대한 항체의 친화성, 그리고 표지된 세포에 의한 광 산란 또는 형광 방출에 기초할 수 있다.

원심 분리 또는 플루오레신 활성화 세포 분류는 주로 물리적 분획에 사용된다. 원심분리는 크기와 침강속도에 따른 셀 분리가 가능하다. 형광 활성 세포 정렬(FACS)은 빛의 산란(예: 세포 크기)이나 형광 방출( 침투된 DNA, RNA, 단백질, 항원)에 의해 감지될 수 있는 차이를 기반으로 세포를 정렬한다. 이것은 플로우 사이토미터 또는 형광 활성화 셀 분류기를 사용하여 수행될 수 있다.

세포 주기의 단계

세포 주기는 3가지 주요 단계로 존재한다:

1. G0/G1 단계 – 세포 정지 및 후속 세포 분열에 대비한 회복

2. S 단계 – DNA 복제(단계 간)

3. G2/M 상 – 염색체 분리 및 유사분열

세포 주기의 단계

아래 샘플 프로토콜은 최적화되어 있으며 화학적 차단에 의한 세포 동기화에 초점을 맞추고 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 서로 다른 화학 물질은 세포 주기의 다른 단계에서 세포 동기화를 유도할 수 있습니다(아래 표 참조).

CD4+ T helper cell는 선천 면역과 적응 면역 사이의 중요한 다리 역할을 합니다. 이 세포들은 B 세포에 항원을 제시함으로써 항체의 생산을 촉진합니다. T 세포는 그들의 특이적인 역할, marker, 분비된 사이토카인(아래 목록 참고)에 따라 더 세분화됩니다.

대상 세포 주기 단계	사용된 치료법
G1 체포	이중 티미딘 블록, 혈청 기아, 사이클린 의존성 인산화효소 억제
G2 체포	미소관 억제, 사이클린 의존성 인산화효소 억제
G2/M 체포	RO-3306
M 상	택솔, 노코다졸

이중 티미딘 블록을 통한 셀 동기화

걸음	절차
1.	G1/S 경계에서 세포를 동기화하기 위해 새로 준비된 티미딘 용액(16 mM)을 완전 배지로 구성하고 0.22 µm 필터 디스크를 사용하여 필터 멸균했다.
2.	세포(1 X 107)는 티미딘(2 mM)이 함유된 60ml 완전 배지에서 175 cm3 세포 배양 플라스크에서 16시간 동안 배양하였다.
3.	그런 다음 세포가 세포 주기에 다시 들어갈 수 있도록 8시간 동안 완전 배지(52.5ml)에서 세포를 다시 매달았다.
4.	셀은 400 x g에서 5분간 원심분리하여 채취한 후 X 2를 완전 배지(10 ml)에서 세척하였다. 세포(1 X 107)를 티미딘(2mM)이 함유된 60ml 완전 배지에서 16시간 동안 배양하여 G1/S 경계에서 세포를 동기화시켰다.
5.	세포 동기화는 흐름 세포 측정법에 의해 확인되었다.

노코다졸 치료에 의한 세포 동기화

걸음	절차
1.	세포(1 x 107)는 노코다졸(100nM)로 18시간 동안 세포를 처리하여 유사분열에서 동기화되었으며 175cm2의 온도에서 37°C에서 배양되었다
2.	셀을 완전 배지 X3로 세척하고 완전 배지로 다시 도금한 후 시료를 0, 30, 60, 120 및 180분 후에 채취하였다.
3.	대조군으로, 한 개의 샘플을 유사분열에서 세포를 유지하기 위해 노코다졸(100nM)이 있는 상태에서 다시 도금했고, 샘플은 방출 후 180분이 걸렸다.
4.	세포는 RIPA buffer에서 용해되었고 전체 세포 추출물이 준비되었다. 샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

CDK 억제제를 사용한 세포의 유사 동기화 치료

걸음	절차
1.	K562 세포는 앞서 설명한 바와 같이 이중 티미딘 블록(DTB)에 의해 G1/S 상에서 억제되었다(첫 번째 샘플 프로토콜 참조)
2.	셀은 400 x g에서 5분간 원심분리하여 채취한 후 X 2를 완전 배지(10 ml)에서 세척하였다.
3.	그런 다음 세포(1 x 106/ml)를 완전 배지에 재부유하고 1시간 동안 휴지시켰다.
4.	세포는 DTB 세포를 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 Taxol(1µM) 중 하나로 11시간 동안 처리했다. DTB 세포는 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 키나제 억제제로 2시간 동안 처리한 후 프로테아솜 억제제인 MG-132(10µM)를 BI2536 (10 µM) Roscovitine (20 µM) , RO-3306 (9 µM), Purvalanol A (10 µM)했다
5.	세포는 RIPA 버퍼로 용해되었고 전체 세포 추출물이 준비되었다.
6.	샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

CDK 억제제를 사용한 Taxol 체포 세포의 M상

걸음	절차
1.	세포(1 x 106)를 차량(0.1%(v/v) DMSO), Taxol(1µM) 또는 Nocodazole(1µM) 중 하나로 12시간 동안 처리했다.
2.	세포는 키나제 억제제인 Roscovitine(20 µM) 또는 Roscovitine과 프로테아솜 억제제인 MG-132(10 µM)로 2시간 동안 처리하였다. 세포는 400 x g에서 5분 동안 원심분리하여 30 µl RIPA 버퍼로 용해하였다.
3.	샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

RO-3306 유도 G2/M K562 세포 정지용한 세포의 유사 동기화 치료

걸음	절차
1.	K562 세포는 18시간 동안 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 RO-3306(9µM)으로 처리되었다.
2.	셀을 완전 배지에서 세 번 세척하고 차량(0.1%(v/v) DMSO) 또는 MG-132(10µM)로 처리된 완전 배지 10ml에 다시 도금했다.
3.	세척 후 0, 15, 30, 45, 60 및 90분에 검체를 채취했습니다.
4.	K562 세포를 RIPA 버퍼로 용해하고 전체 세포 추출물을 준비하였다.
5.	샘플은 -20 °C에서 저장되었습니다.

셀 동기화 확인

세포의 동기화는 현미경 검사나 흐름 세포 측정을 통해 확인할 수 있다. 현미경을 통해 세포 안에서 실제로 무슨 일이 일어나고 있는지 볼 수 있습니다. 플로우 세포 측정을 사용하면 처리된 동기화된 세포를 비동기 제어와 비교할 수 있습니다. 간략하게 프로토콜은 다음과 같습니다:

걸음	절차
1.	70% 에탄올에 세포를 고정하고 투과시킵니다
2.	요오드화 프로피듐 40µg/ml로 염색하고, 25µg/ml의 RNase를 포함한다(RNA를 분해하고 DNA만 염색하도록 한다).
3.	플로우 세포계에서 샘플을 실행합니다.

Written by Rithika Suresh

Rithika Suresh completed her undergraduate degree in Biotechnology in Anna University before completing her masters in Biotechnology at University College Dublin.