PCR : 종류 및 용도

PCR은 분자생물학의 초석으로, 과학자들이 놀라운 정밀도로 DNA 조각을 확대하고 분석할 수 있도록 해줍니다. 이 블로그에서는 기본 원리부터 연구, 진단 등을 혁신한 다양한 기술에 이르기까지 PCR에 대한 이해를 시작하겠습니다.

주요 시사점

PCR은 연구, 진단 및 법의학에서 중요한 DNA 증폭을 위한 중추적인 기술입니다.

Hot Start PCR, RT-PCR, qPCR과 같은 변종은 특이성을 강화하고, RNA를 분석하고, 핵산을 정량화합니다.

High Fidelity Polymerase 및 Digital PCR과 같은 발전은 돌연변이 및 부족한 유전자를 검출하는 데 정확성을 제공합니다.

PCR

중합효소연쇄반응(PCR)은 DNA의 특정 부분을 증폭하여 단일 DNA 조각에서 수백만 개의 복사본을 생성하는 데 사용되는 강력한 실험실 기술입니다. 1980년대에 개발된 PCR은 생물학 연구, 진단, 법의학 등 다양한 분야에서 필수적인 도구가 되었습니다. 이는 과학자들이 제한적이거나 품질이 저하된 샘플에서도 분석을 위해 충분한 양의 DNA를 생성할 수 있도록 함으로써 DNA 분석에 혁명을 일으켰습니다.

PCR 과정은 일련의 온도 의존적 단계를 포함하며 DNA 중합효소를 활용하여 새로운 DNA 가닥의 합성을 촉매합니다. PCR 과정을 단계별로 설명하면 다음과 같습니다.

1. 변성(94-98°C): 이중 가닥 DNA 주형은 일반적으로 약 94-98°C의 고온으로 가열됩니다. 이로 인해 상보적인 DNA 가닥 사이의 수소 결합이 끊어져 두 가닥이 분리됩니다. 이 단계를 흔히 "용융"이라고 합니다.

2. 어닐링(50-65°C): 온도를 특정 범위(일반적으로 50-65°C)로 낮추어 짧은 DNA 프라이머가 표적 DNA 영역의 시작 부분에 있는 상보적 서열에 결합할 수 있도록 합니다. 이 프라이머는 DNA 합성의 출발점 역할을 합니다.

3. Extension(72°C): DNA 중합효소(보통 Taq 중합효소)가 주형 가닥에 상보적인 뉴클레오티드를 추가하여 새로운 DNA 가닥을 합성하는 최적의 온도인 72°C 정도까지 온도를 높입니다. 프라이머는 새로 합성된 DNA 가닥의 순서를 지정합니다.

변성, 어닐링, 확장이라는 세 단계는 일반적으로 특정 주기(보통 약 20~40주기) 동안 반복됩니다. 각 주기마다 DNA 양이 두 배로 늘어나서 표적 DNA 세그먼트가 기하급수적으로 증가합니다.

표준 PCR 기술은 구아닌/시토신이 풍부한(GC가 풍부한) 영역을 처리할 때 장애물에 직면합니다. GC가 많은 시퀀스는 GC가 적은 시퀀스보다 더 안정적입니다. 또한 GC가 풍부한 시퀀스는 헤어핀 루프와 같은 2차 구조를 생성할 가능성이 더 높습니다. 결과적으로 변성 단계에서 GC가 풍부한 이중 가닥을 완전히 분리하는 것이 어렵습니다. 결과적으로 DNA 중합효소는 새로운 가닥을 생성하는 데 어려움을 겪습니다. 이는 더 높은 변성 온도와 더 짧은 어닐링 시간으로 변경하면 더 좋아질 수 있으며, 이는 GC가 풍부한 프라이머의 비특이적 결합을 방지하는 데도 도움이 됩니다. 추가 시약을 추가하면 GC가 풍부한 시퀀스의 증폭이 향상될 수 있습니다. GC 상호작용으로 인한 2차 구조의 파괴로 인해 DMSO, 글리세롤 및 베타인을 적용하면 이중 가닥의 분리가 촉진됩니다.

핫 스타트 PCR

Hot-Start PCR은 DNA 증폭의 특이성과 효율성을 향상시키도록 설계된 전통적인 중합효소연쇄반응(PCR) 기술의 수정된 버전입니다. 이는 반응 설정의 초기 단계에서 DNA 중합효소 효소의 조기 활성화로 인해 비특이적 증폭이 발생할 수 있는 표준 PCR의 일반적인 문제를 해결합니다. 이로 인해 원하지 않는 제품이 생성되고 전반적인 특이성이 감소할 수 있습니다. Hot-Start PCR에서는 PCR 과정의 초기 설정 및 초기 가열 단계와 같은 저온에서 DNA 중합효소가 활성화되는 것을 방지하기 위한 조치가 취해집니다. 비특이적인 산물의 증폭을 방지하고 의도한 표적 서열의 증폭을 높이는 것이 목표입니다. 이는 복잡한 DNA 템플릿을 사용하거나 미량의 표적 DNA가 포함된 샘플을 처리할 때 특히 유용합니다. Hot-Start PCR의 장점에는 향상된 특이성, 향상된 감도 및 최적화 감소가 포함됩니다.

Hot-Start PCR 기술을 구현하는 데 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다.

물리적 분리: 일반적인 접근 방식 중 하나는 초기 설정 중에 DNA 중합효소를 DNA 주형 및 프라이머에서 물리적으로 분리하는 것입니다. 이러한 분리는 변형된 DNA 중합효소 또는 항체 기반 기술을 사용하여 이루어집니다. 예를 들어, 항체는 반응이 가열될 때까지 중합효소의 활성을 억제하는 데 사용될 수 있으며, 이 시점에서 항체는 변성되어 중합효소가 활성화될 수 있습니다.

화학적 변형: 또 다른 방법은 DNA 중합효소 효소 자체를 화학적으로 변형하는 것입니다. 낮은 온도에서 효소를 비활성화시키는 화학적 변형이 효소에 추가됩니다. 초기 가열 단계에서 반응 온도가 증가함에 따라 이러한 변형이 제거되어 DNA 증폭을 위한 효소가 활성화됩니다.

Hot-Start Taq Polymerase: 일부 상업용 DNA 중합효소는 실온 이하에서는 비활성화되지만 온도가 높아지면 활성화되도록 설계되었습니다. 종종 "Hot-Start Taq Polymerase"라고 불리는 이러한 특수 효소는 항체 매개 억제, 가역적 화학적 변형 또는 반응이 적절하게 가열될 때까지 활성을 방지하는 기타 메커니즘을 보유합니다.

고충실도 중합효소

DNA 중합효소가 원래의 주형 서열을 매우 정확하게 증폭하더라도 뉴클레오티드 일치 오류가 발생할 수 있습니다. 복제와 같은 응용 분야에서 불일치로 인해 전사본이 짧아지고 잘못 번역되었거나 비활성화된 단백질이 발생할 수 있습니다. 이러한 불일치를 방지하기 위해 "교정" 활동이 있는 중합효소가 발견되어 작업흐름에 통합되었습니다. Pyrococcus furiosus에서는 최초의 교정 중합효소인 Pfu가 1991년에 발견되었습니다. 이 Pfu 효소의 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성. 엑소뉴클레아제는 DNA가 증폭됨에 따라 가닥의 3' 말단에서 일치하지 않는 뉴클레오티드를 제거합니다. 그런 다음 적절한 뉴클레오티드가 대체되고 DNA 합성이 계속 진행됩니다.

비효과적인 결합이 합성을 지연시키고 올바른 대체를 허용하는 경우, 효소에 대한 적절한 뉴클레오시드 삼인산의 결합 친화도는 잘못된 뉴클레오티드 서열을 식별하는 데 사용됩니다. Taq DNA 폴리머라제에 비해 Pfu 폴리머라제의 교정 활성은 최종 서열에서 오류가 적습니다. DNA 증폭 시 실수율을 더욱 낮추기 위해 최근 추가적인 교정 효소가 발견되었으며, 원래의 Pfu 효소를 변형하였습니다.

RT-PCR

일반적으로 RT-PCR로 알려진 역전사 중합효소 연쇄 반응은 역전사와 중합효소 연쇄 반응의 원리를 결합한 강력한 분자 생물학 기술입니다. 이 방법은 RNA 분자를 분석 및 증폭하고 추가 분석을 위해 이를 상보적 DNA(cDNA)로 변환하도록 특별히 설계되었습니다.

이 과정은 역전사 효소라는 효소가 단일 가닥 RNA 분자를 주형으로 사용하여 상보성 DNA 가닥(cDNA)을 합성하는 역전사 단계로 시작됩니다. 많은 생물학적 과정이 유전자 발현 및 바이러스 복제와 같은 RNA와 관련되어 있고 RNA를 cDNA로 변환하면 연구자가 이러한 과정을 더 쉽게 연구할 수 있기 때문에 이 단계는 매우 중요합니다.

cDNA가 생성되면 특정 표적 서열을 증폭하기 위해 중합효소 연쇄 반응이 사용됩니다. 여기에는 반응 혼합물을 가열하고 냉각하는 반복적인 주기가 포함됩니다. 가열 단계(변성) 동안 DNA 가닥이 분리되어 단일 가닥 주형이 생성됩니다. 냉각 단계(어닐링)에서는 표적 cDNA 서열에 결합하도록 특별히 설계된 짧은 DNA 프라이머가 주형에 부착됩니다. 그런 다음 열에 안정한 DNA 중합효소가 상보적인 뉴클레오티드를 추가하여 프라이머를 확장하여 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.

RT-PCR의 최종 결과는 원본 RNA 샘플에서 증폭된 양의 cDNA로, 연구자들은 유전자 발현 수준을 연구하고, 바이러스 감염을 감지하고, RNA 서열을 분석하는 등의 작업을 수행할 수 있습니다. RT-PCR은 코로나19와 같은 질병을 탐지하는 데 사용되는 의료 진단부터 유전자 기능 및 조절을 탐색할 수 있는 분자생물학 연구에 이르기까지 다양한 분야에서 매우 귀중한 것으로 입증되었습니다. RNA를 DNA로 변환한 다음 특정 서열을 증폭시키는 능력으로 인해 RT-PCR은 현대 분자생물학에서 없어서는 안 될 도구가 되었습니다.

qPCR 및 RT-qPCR

많은 응용 분야에서 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 핵산을 검출, 설명 및 정량화합니다. RT-qPCR에서 RNA 전사체는 앞서 언급한 바와 같이 먼저 cDNA로 역전사되어 정량화되는 경우가 많으며 그런 다음 qPCR이 수행됩니다. 변성, 어닐링, 신장은 기존 PCR과 마찬가지로 DNA를 증폭하기 위해 반복되는 세 가지 과정입니다. 그러나 qPCR에서는 형광 표지를 사용하여 PCR이 진행되면서 데이터를 수집할 수 있습니다. 접근 가능한 다양한 기술과 화학으로 인해 이 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다.

dsDNA 결합 염료를 사용하는 형광 라벨링을 사용하면 염료 기반 qPCR(보통 녹색)에서 증폭된 DNA 분자를 측정할 수 있습니다. 형광은 각 주기에 걸쳐 측정됩니다. 복제된 DNA의 양에 따라 형광 신호가 증가합니다. 결과적으로 DNA는 "실시간"으로 측정됩니다. 염료 기반 qPCR을 사용하면 한 번에 하나의 표적만 분석할 수 있으며, 샘플에서 발견된 모든 ds-DNA로 인해 염료가 결합됩니다.

프로브 기반 qPCR을 사용하면 각 샘플에서 많은 표적을 동시에 식별할 수 있지만 이를 위해서는 프라이머 외에 사용되는 표적 특이적 프로브의 생성 및 개발이 필요합니다. 다른 종류의 프로브 디자인도 있지만 가장 널리 사용되는 종류는 형광단과 소광제를 결합한 가수분해 프로브입니다. 프로브가 여전히 손상되지 않은 경우 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 형광단이 소광제를 통해 방출되는 것을 중지합니다. 그러나 프로브는 PCR 반응 중에 연결된 특정 서열의 프라이머 연장 및 증폭 중에 가수분해됩니다. 증폭에 따라 형광이 증가하는 것은 탐침의 분열로 인해 발생하며, 이로 인해 소광제에서 형광단이 유리됩니다.

결과적으로, 샘플에 존재하는 프로브 표적 서열의 양은 프로브 기반 qPCR 프로세스의 형광 신호와 직접적인 상관관계가 있습니다. qPCR 기반 진단 테스트에서는 프로브 기반 qPCR이 염료 기반 qPCR보다 더 정확하기 때문에 자주 사용됩니다.

등온 증폭

변성, 어닐링 및 확장 단계에 대해 챔버 온도를 정확하게 높이거나 낮추기 위해 위에서 설명한 PCR 방법의 경우 고가의 열순환 장비가 필요합니다. 그렇게 정확한 장비가 필요하지 않고 표적 세포 내부나 심지어 간단한 수조에서도 사용할 수 있는 수많은 방법이 고안되었습니다. 통칭하여 등온 증폭이라고 하는 이러한 방법은 지수, 선형 또는 계단식 증폭의 원리에 따라 작동합니다.

루프 매개 등온 증폭(LAMP)은 등온 증폭의 가장 잘 알려진 종류입니다. LAMP는 650C에서 지수 증폭을 사용하여 주형 DNA 또는 RNA를 증폭합니다. LAMP는 표적 DNA의 특정 부분에 상보적인 DNA 중합효소와 4~6개의 프라이머를 사용하여 새로운 DNA를 생성합니다. 이들 프라이머 중 2개의 상보적 서열이 다른 프라이머의 서열을 인식하고 이에 결합함으로써 새로 합성된 DNA에 "루프" 구조가 형성될 수 있습니다. 이 구조는 후속 증폭 라운드에서 프라이머 어닐링을 촉진합니다. 형광, 아가로스 겔 전기영동 또는 비색법과 같은 다양한 기술을 사용하여 LAMP를 확인할 수 있습니다.

LAMP는 임상 실험실 테스트에 쉽게 접근할 수 없는 위치, 샘플 보관 및 운송이 실용적이지 않은 위치 또는 시각화가 간단하고 이전에 PCR 열 순환 장비가 없었던 실험실에서 SARS-CoV-2 테스트에 적합한 대안이었습니다. 비색법으로 제품 유무를 검출할 수 있어 고가의 장비가 필요하지 않습니다.

디지털 PCR

디지털 중합효소 연쇄 반응(디지털 PCR)은 기존 PCR의 원리를 새로운 수준의 정밀도와 감도로 끌어올리는 최첨단 분자생물학 기술입니다. 디지털 PCR은 샘플에 존재하는 DNA 또는 RNA 분자가 매우 낮은 농도로 존재하는 경우에도 정확하게 정량화하고 분석하는 데 사용됩니다.

디지털 PCR에서 샘플은 수천 개의 개별 반응으로 분할되며, 각 반응에는 단일 분자 또는 몇 개의 표적 DNA 또는 RNA 분자가 포함되어 있습니다. 이러한 분할은 미세유체 장치 또는 특수 유제 기술을 사용하여 달성됩니다. 각각의 분할된 반응은 소형 PCR 반응으로 작용하며, 존재 여부에 따라 표적 DNA/RNA가 증폭되거나 증폭되지 않은 상태로 유지됩니다.

증폭 후 파티션을 분석하고 양성 파티션(증폭이 발생한 파티션)과 음성 파티션(증폭되지 않은 파티션)의 수를 계산합니다. 이 정보는 원본 샘플에 포함된 표적 분자의 절대량을 계산하는 데 사용됩니다. 높은 정밀도로 희귀 서열을 검출하고 정량화하는 디지털 PCR의 능력은 유전적 돌연변이 검출, 낮은 수준의 유전자 발현 연구, DNA 또는 RNA의 복잡한 혼합물 분석과 같은 응용 분야에 특히 유용합니다.

기존 정량적 PCR(qPCR)에 비해 디지털 PCR은 감도 향상, PCR 억제제에 대한 민감성 감소, 소량 표적에 대한 정확도 향상 등 여러 가지 이점을 제공합니다. 이는 의료 진단, 유전자 검사, 환경 모니터링 등 핵산의 정확한 정량화가 중요한 다양한 분야에서 강력한 도구입니다. 디지털 PCR은 표적 분자의 디지털 절대 정량화를 제공함으로써 보다 신뢰할 수 있고 정확한 분자 분석에 기여합니다.

결론적으로, 중합효소 연쇄반응(PCR)과 그 다양한 유형에 대한 이러한 탐구는 이 혁명적인 분자생물학 기술의 가장 중요한 중요성을 강조합니다. PCR 기술을 통해 핵산을 적절하게 증폭하고 분석함으로써 복잡한 유전 정보를 풀고 이전에는 접근할 수 없었던 통찰력을 밝힐 수 있습니다. 우리의 조사는 역전사 PCR(RT-PCR)과 그 다각적인 응용을 포괄하는 PCR 변종의 복잡성을 조사했습니다. 이러한 방법론과 고유한 기능에 대한 설명은 현대 분자 생물학 연구 및 진단에서 이들이 수행하는 중요한 역할을 강조하는 데 도움이 됩니다.

2nd Sep 2024 Sana Riaz

##면역학 #미생물학 #프로토콜

항체 구조: 개요 및 통찰력

산화 스트레스: 원인, 바이오마커 및 질병

세포 사멸에 대한 포괄적인 개요

색소성 건피증: 원인, 유전, 치료 및 진단