Assay Genie Fatty Acid Oxidation Kit는 세포 및 조직에서 지방산 산화의 정량
측정을 위한 매우 민감한 비색계 검사입니다.
이 특별한 분석은 18C
unsaturated fatty acid oleate(18C 불포화 지방산 올레산과) 같은 낮은 용해도의
long chain 기질과 비교했을 때 지방산 산화를 정확하게 측정할 수 있는 높은
용해도의 Octanoly-CoA 기질을 사용합니다.
FAO Assay 주요 특징:
Assay Type:
Cell based (quantitative)
Detection Method:
Colorimetric
Platform:
Microplate reader
Sample Type:
Cells and tissues
FAO Assay 구성 요소:
구성 요소:
용량:
보관 조건:
FAO Assay Solution
5 ml (for 100 wells)
-70°C (실험동안 용액을 빛으로부터 차단한다)
FAO Substrate
20x - 0.25 ml
-70°C
Cell Lysis Solution
10x - 25 ml
-4°C
Fatty Acid Oxidation
지방산(Fatty acid)은 포도당과 같은 탄수화물보다 탄소 당 더 많은 ATP를
제공합니다. 심장조직과 같은 에너지 요구량이 높은 조직에서는 에너지의 최대
50-70%가 지방산 beta-oxidation으로부터 오는데, 이때 미토콘드리아에서
지방산이 acetyl-CoA로 변환되면서FADH2와 NADH가 부수적으로 생산됩니다.
이 엄격한 호기성 산화(aerobic oxidation) 경로는 4가지 단계로 구성됩니다 :
Acyl-CoA dehydrogenase에 의한 acyl-CoA dehydrogenation(탈수소화), enoyl-CoA
hydratase에 의한 hydration(수화), 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase에 의한
탈수소화, by beta-ketothiolase에 의한 thiolytic cleavage.
Fatty Acid Oxidation연구의 중요성
사람에서 beta-oxidation 시스템의 중요성은 fatty acid oxidation
disorders(FAODs, 지방산 산화 장애)로 분류되는 유전질환 그룹의 존재로 확인 할
수 있습니다. 이는 지방산 수송 및 산화과정의 결함을 나타내는 다양한 질환들로,
상염색체 열성 장애로 유전되며 광범위한 임상적 증상을 나타냅니다.
Assay Genie의 non-radioactive FAO assay는 기질 octanoyl-CoA의 산화를 기초로
합니다. NADA의 생성은 tetrazolium salt INT가 formazan으로 환원되는 것과
관련이 있습니다. 붉은색의 formazan의 강도는 FAO활성의 증가와 비례합니다.
Assay solution과 기질은 분주하여 -80°C 에 저장해야 합니다.한다. 검사
용액과 기질은 -80°C의 분취에 저장해야 합니다.
Figure 1: Fatty Acid Oxidation Assay: 건강한
햄스터 심장과 심부전과 관련된 TO2 햄스터 모델의 심장에서 조직
용해물(lysate)을 준비하였다. 용해물은 시험에 사용되어 지방산 산화
정도를 정량화하였다.
얼음처럼 차가운 phosphate-buffered saline(PBS)로 최대 106개의 세포를
두번 세척하고, cell pellet에서 PBS를 완전히 제거한다. Cell
pellet은-80˚C에서 보관해야 한다. 조직 샘플은 PBS로 철저히 세척하여
혈액세포를 제거한다. 혈액세포는 실험결과의 일관성을 저해할 수 있다.
2.
10x Cell Lysis solution을 얼음처럼 차가운 dH2O로 희석하여 1x Cell
Lysis solution을 충분히 준비한다. 얼음처럼 차가운1x Cell Lysis
solution 50~100 µl을 cell pellet에 첨가한다. 위아래로 피펫팅하여
세포를 추출한다. 간헐적으로 부드럽게 섞어주며 5분 동안 lysate를 얼음
위에 둔다. Lysate에 점성이 있으면1x Cell Lysis solution을 넣고
피펫팅을 반복한다. 냉장 원심분리기로 lysate를 최대 속도로 5분 동안
원심분리한다. 검사를 위해 상등액을 회수한다. 조직은 1x Cell Lysis
solution에서 균질화(homogenization)하고, lysate를 원심분리하여
투명하게한다. 조직 균질화를 위해 1x Cell Lysis Solution 0.5ml당 최대
25 mg의 조직을 사용한다.
3.
Protein assay를 수행하여 샘플 단백질 농도를 확인한다. 시료 단백질
농도는 얼음처럼 차가운 1x Cell Lysis 용액으로1~3 mg/ml로 희석하여
normalize한다. 단백질 샘플은 항상 얼음 위에 보관한다. 냉동-해동된crude
protein(조단백질) lysate는 효소 활성이 감소될 수 있다. Lysate는
-80˚C에서 저장해야 한다. 참고: 환원제(reducing agent) 또는 SDS가
포함된 버퍼를 사용하지 않는다.
시약 해동:
해동된 FAO Assay Solution과 20x FAO Substment를 얼음 위에 보관합니다. 피펫팅
전에 용액을 부드럽게 섞어줍니다. 시약이 해동되는 시간을 최소화하는 것이
중요합니다. 사용 후 즉시 용액을 얼리십시오.
Control Solution및 Reaction Solution 준비::
Control solution은 dH2O 1: FAO Assay Solution 20 비율로 혼합하여
제조됩니다(예: 25 µl dH2O와 500 µl FAO Assay Solution). 실험중에는 새로
준비한 control solution을 얼음 위에 보관하십시오.
Reaction solution은 20x FAO substrate 1: FAO Assay Solution 20 비율로
혼합하여 제조합니다. 예를 들어, 25 µl 20x FAO Assay Solution은 500 µl
FAO Assay Solution과 혼합합니다. 용액을 얼음에 보관하고 즉시 사용하세요.
각 단백질 샘플은 50 µl control solution과 50 µl reaction solution 두개의
구분된 세트로 처리합니다.
단계
과정
1.
각 단백질 샘플 10µl를 96well plate에 이중으로(duplicate) 가한다. 참고:
약물 개발에 적용할 경우, 두 well 모두에 약물 억제제 1µl를 추가하고
위아래로 피펫팅하여 검체와 혼합한다.
2.
모든 검체를 플레이트에 피펫팅한 후에는 한 set of wells에 50µl control
solution을, 다른 set of wells에는 50µl reaction solution을 신속하게
가한다. 내용물을 30초간 부드럽게 섞는다. 판을 덮고 humified 37°C
incubator에서 1~2시간 배양한다. FAO activity는 well에서 체리 레드
색상을 생성한다. CO2 인큐베이터를 사용하지 않는다. 참고: 빨간색이 거의
검출되지 않으면 검체 단백질 농도 및/또는 배양 시간을 늘린다.
3.
각 control solution well과 reaction solution well에3% 아세트산(키트에
포함되지 않음) 50µl를 첨가한 후 잠시 부드럽게 섞어 반응을 중지시킨다.
Plate reader를 사용하여 O.D.492nm를 측정한다.
4.
각 샘플에 대한 reaction well 판독값에서 control well 판독값을 뺀다.
감산된 O.D. 수치는 검체의 fatty acid oxidation activity에 비례한다.
1) 세포를 이용해 검사해 보셨나요? 만약 안해봤을 경우, 106이 적절한
수치인지 어떻게 알 수 있나요? 더 적은 양을 사용해도 되나요?
FAO activity는 미토콘드리아 함량에 의해 유도되기 때문에, 대부분의 배양
세포는 낮지만 검출 가능한 FAO activity를 나타냅니다. FAO 검출을 위한 농축
단백질 추출물을 만들기 위해서 10^6개의 세포가 필요합니다.
2) 냉동 조직에서도 assay를 사용할 수 있나요? Assay가 작동하기 위해서
active enzyme에 의존하지 않나요?
이 검사는 냉동 조직에도 적용할 수 있습니다. 이것은 enzyme
activity assay입니다.
3) 결과를 결정하기 위해 표준 곡선(standard curve)을 생성하는 방법은
무엇입니까?
이 Assasy에서는 표준 곡선은 이용되지 않습니다. 광학
밀도(optical density)는 효소 단위(enzyme units)로 변환될 수 있습니다.
4) FAO에 어떤 종류의 inhibitor를 사용할 수 있나요?
FAO inhibitor는 테스트 되지 않았습니다.
5) 배양된 세포에 대한 검사를 위해 어떤 대조군들을 추천하시나요?
미토콘드리아 함량이 높은 cell/tissue를 양성 대조군으로 사용할 수
있습니다.
6) 이 검사는 전혈 검체(whole blood sample) 또는 정제 PBM에 사용할 수
있습니까?
샘플의 빨간색은 492nm에서 광학 감지를 방해합니다. PBMC는 혈액
세포가 없는 경우 표준 프로토콜을 사용하여 처리할 수 있습니다.
7) 이 assay로 식물 세포 및 조직의 Fatty Acid Oxidation를 측정할 수
있나요?
아직 식물세포로 검사한 적은 없지만, 이 assay는 면역학적
검사라기보다는 화학적인 검사이기 때문에 효과가 있을 것으로 예상합니다.
8) 이 assay는 extracellular fluid에 이용할 수 있나요?
이 assay는 extracellular fluid에 적용되지 않습니다.
9) Long chain FA에 적용 가능한가요?
우리는 검사를 위한 기질로 long chain fatty acid을
테스트했습니다. 그러나 long chain fatty acid의 낮은 수용성은 분석 결과를
신뢰할 수 없게 만드는 문제를 제기합니다.
10) Long-chain FA를 측정하는 것이 FAO 더 정확한 측정을 위해 필요한가요?
Short-chain과 Medium-chain에는 mitochondrial CPT가 필요하지 않지만,
long-chain은 필요합니다.
아니요, CPT는 미토콘드리아 구조가 유지되는 온전한 장기/세포
체계에만 관련이 있습니다. 그러나 FAO 검사는 조직/세포의 homogenates(균질액)
사용을 기반으로 하므로, CPT의 활성은 in vivo assay 시스템에서 측정할 수
없습니다.
11) 키트는 octanoly-CoA에서 생성된 NADH와 endogenous tissue
substrates(glycogen, triglycerides 등)에서 생성된 NADH를 어떻게
구별하나요?
프로토콜에 따라 준비된 control solution은 endogenous tissue
substrates로부터 NADH 생성을 측정할 것입니다. control solution으로 얻은
optical density(광학밀도)는 FAO 활성의 최종 계산에서 차감됩니다.
12) Standard가 없는 것 같습니다. FAO activity는 계산됩니다. 30분, 60분에만
측정해야 하는 경우 30분에 ΔOD를 생성하려면 어떻게 해야 합니까? 시간 0에도
측정하면 되나요?
30분, 60분, 90분 또는 120분에 반응을 멈추지 않고 OD를 측정할 수
있습니다.
13) 10x cell lysis solution은 바닥에 녹지 않는 것처럼 보이는 하얀 침전물이
많습니다. 다시 녹이기 위해서 용액을 데워야 할까요?
네, 드라이아이스로 인해 용액이 얼어서 그렇습니다.
교반(agitation)시키면서 용액을 데우세요.
Standage et al.
NMR-based serum and urine metabolomic profile reveals suppression of
mitochondrial pathways in experimental sepsis-associated acute kidney
injury
American Journal of Physiology-Renal Physiology
(2021)
