3D 세포 배양: 분석 가이드

참고자료

키 포인트

3차원(3D) 세포 배양은 세포가 3D 방식으로 주변 환경과 성장하거나 상호 작용하도록 허용되는 인공적으로 만들어진 환경입니다.
3D 세포 배양은 생리학적 조건과 더욱 유사하며 생체 내 성공에 대한 더 나은 지표를 제공할 수 있습니다. 3D 세포 배양을 배양하고 정량화하는 데 도움이 되는 분석 및 키트가 존재합니다.

내용물

배경
3D 세포 배양이란 무엇입니까?
장점과 단점
경작
지하 멤브레인 매트릭스
알지네이트 하이드로겔
분석
수확 키트 XTT
3D 생존력 분석 WST-1
LDH 및 아데닐산 키나제 WST-8

배경

3D 세포 배양이란 무엇입니까?

오늘날 약물 발견에 사용되는 모든 배양 모델 중에서 3차원 세포 배양 모델보다 암 연구 분야에서 더 많은 가능성을 보여준 모델은 없습니다. 특히 암세포 연구에서 세포 집합체로 구성된 종양 타원체는 비인간 동물에 대한 시험으로 이동하기 전에 중재의 생체 내 효능을 더 잘 평가할 수 있는 놀라운 도구가 될 수 있습니다. 유방암에 대한 2014년 연구는 이러한 배양 기술이 어떻게 이질적인 종양 미세 환경을 모델링할 수 있는지 보여주는 강력한 예입니다.
3D 세포 배양은 생체 내에서 볼 수 있는 공간 사용을 모방하는 환경에서 회전타원체와 같은 구조를 허용하여 3차원에 걸쳐 세포를 배양하는 방법입니다. 일반적으로 플레이트 위의 단층에서 세포를 성장시키는 2D 세포 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 확장 및 상호 작용을 위한 또 다른 축을 추가하여 성장을 촉진합니다.
암과 같은 질병에서 올바른 미세환경을 재현하는 것은 약물 및 기타 개입 방법의 진정한 효능을 평가하는 데 중요합니다(출처). 2D 배양 환경에서 세포는 주변 이웃 또는 세포외 기질과 동일한 통신을 하지 않습니다. 3D 환경에서는 이러한 상호 작용을 쉽게 모델링하고 보다 안정적으로 연구할 수 있습니다.
3D 세포 배양은 기존 2D 세포 배양에 비해 세포의 기능, 분화 및 생존력을 향상시키고 미세환경을 더 잘 포착합니다. 3D 매트릭스는 발생 형태 형성, 약리학, 약물 대사 및 약물 독성 연구에서 암 및 줄기 세포를 포함한 많은 세포 유형에 대한 생체 내 반응을 모방하여 생리학적으로 관련된 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.

3D 세포 배양의 장단점

장점
단점
생체 내 조건을 더욱 밀접하게 모방
신뢰할 수 있고 검증된 분석법이 부족함
전임상 및 동물 실험의 성공 여부를 나타내는 더 나은 지표
낮은 배치 간 신뢰성
새로운 개입을 위한 생리학적 관련 스크리닝 프로필
3D 세포 배양 모델을 방해하지 않고 생존 가능성을 평가하기가 어렵습니다.
위에 표시된 것처럼 3D 세포 배양을 사용할 때의 주요 이점은 생체 내 조직 환경 및 상호 작용에 대한 더 나은 모델이라는 것입니다.
현재까지 3D 세포 배양 사용의 주요 단점은 신뢰할 수 있는 분석법이 부족하고 존재했던 분석법이 연구 중인 오르가노이드 또는 구조를 파괴해야 한다는 점이었습니다. 그러나 3D 세포 배양 사용의 단점은 새롭고 향상된 배양 방법 및 분석법의 생산 및 사용으로 해결되었습니다. 마찬가지로 배치 간 가변성이 낮은 문제는 스캐폴드 및 매트릭스의 추가 기능과 이러한 절차의 검증을 보여주는 새로운 연구를 통해 수정되었습니다(출처).

경작

1) 지하막 매트릭스
2) 알지네이트 하이드로겔
지하 멤브레인 매트릭스
기저막은 포유동물의 경계 및 접착 플랫폼 역할을 하는 섬유질 세포외 기질입니다. 당사의 3D 세포 배양 매트릭스 BME 키트에는 3D 회전타원체 성장의 배양 및 측정을 허용하는 기저막 매트릭스와 세척 버퍼가 포함되어 있습니다. 당사의 3D 세포 배양 즉시 사용 가능한 지지체 전체 키트에는 무효소 지지체 해리 용액, 중화 완충액 및 즉시 사용 가능한 지지체가 96웰 플레이트 형태로 포함되어 있습니다.
알지네이트 하이드로겔
알지네이트 하이드로겔은 BME 매트릭스가 포유동물에 사용될 수 있는 것과 거의 동일한 방식으로 식물 세포의 재배에 사용될 수 있습니다. 당사의 3D 세포 배양 매트릭스 알지네이트 하이드로겔 키트(아래 그림 참조)에는 식물 세포의 3차원 회전타원체 성장을 생성하는 데 사용할 수 있는 재료가 포함되어 있습니다. 또한 3D Cell Culture Ready-to-Use Scaffold Complete Kit와도 호환됩니다.
그림 1. 매트릭스가 없는 HepG2 세포와 MCF7 세포의 성장 대 매트릭스 지지체. Calcein AM 염색 시 세포 생존력은 장기간의 매트릭스 배양 중에도 영향을 받지 않는 것으로 나타났습니다.

3D 세포 배양 분석

3D 수확 키트
3D 생존 가능성 분석
아데닐산 키나제
젖산염 탈수소효소
XTT
WST1
WST8(곧 출시 예정)


3D 수확 키트
당사의 3D 세포 배양 비효소 세포 수확 키트는 매트릭스에서 세포와 회전타원체를 분리하는 데 이상적인 솔루션입니다. 기질 분해에 일반적으로 사용되는 두 가지 프로테아제인 트립신 및 아큐타제와는 달리, 이 분석에 사용된 순한 식염수 기반 용액은 프로테아제 소화에 민감할 수 있는 세포에 이상적입니다. 프로테아제는 이러한 과정을 손상시키고 생리학적 평가를 변경할 가능성이 더 높기 때문에 배양 중인 세포를 세포 표면 단백질이나 신호에 대해 평가해야 하는 경우 이는 중요한 요소입니다. 당사의 식염수 기반 솔루션은 매트릭스, 특히 자체 세포 배양 키트의 매트릭스를 완전히 분리하기 위해 최적화되고 표준화되었습니다.
매트릭스에서 세포와 회전타원체를 분리하는 것은 세포 계대, 생화학적 과정 또는 단백질 분석의 최종 평가에서 핵심 단계입니다. 이 키트를 사용하면 후속 생화학, 단백질 및 세포 기반 분석을 위해 높은 생존율로 이러한 세포를 분리할 수 있습니다.
3D 생존 가능성 분석
3D 세포 배양 HTS 세포 생존 가능성 분석 키트 분석은 부드러운 비방사성, 비효소 방법을 사용하여 샘플의 생존 가능성을 테스트합니다. 이 분석 키트는 세포 생존력, 세포 독성 및 세포사멸을 특성화하고 스크리닝하기 위한 빠르고 사용자 친화적이며 처리량이 높은 스크리닝 방법을 제공합니다. 당사의 키트는 세포의 민감한 정량화를 위한 표준화된 형광 측정 방법을 제공하며, 이는 웰에서 50개 정도의 생존 가능한 세포를 검출할 수 있습니다. 세포 증식, 세포 생존력, 화학주성, 세포 독성 및 세포사멸을 평가하는 데 적합합니다. 이 키트에는 매트릭스 해리 식염수 용액, 생존도 분석 완충액, Calcein AM이 포함되어 있으며 모든 포유류 세포 유형과 호환됩니다.
매트릭스와 회전타원체가 3D 배양에서 해리되면 세포 성장을 평가할 수 있습니다. 마찬가지로, 이 키트를 사용하면 성장 인자, 사이토카인, 미토겐 및 영양소에 반응하여 세포 생존력을 측정할 수 있습니다. 세포 성장이나 회전 타원체 형성에 영향을 줄 수 있는 항암제, 독성 물질 또는 기타 의약품과 같은 세포 독성 또는 세포 증식 억제 화합물의 효과를 측정할 수 있습니다.
아데닐산 키나아제(AK)
아데닐산 키나아제는 모든 진핵 세포와 원핵 세포의 원형질막에 존재하는 편재된 단백질입니다. 막이 손상되면 이 단백질은 배양 배지로 방출됩니다. 따라서 AK는 세포독성의 강력한 지표이며 생존력 측정을 위한 대용으로도 사용할 수 있습니다.
GenieGlow 세포독성 분석 키트는 3D 세포 배양 비효소 세포 수확 키트와 결합하여 3차원 모델에서 세포 생존력을 측정하는 빠르고 민감한 분석입니다.
젖산염 탈수소효소(LDH)
젖산염 탈수소효소(LDH)는 원형질막 손상 시 세포 배양 배지로 빠르게 방출되는 안정적인 효소입니다. 이는 모든 세포 유형에 존재하므로 세포 독성의 강력한 지표입니다. 3D 세포 배양에서 세포 독성을 평가하는 잘 특성화된 방법은 단순히 존재하는 배지를 제거하고 96웰 플레이트에서 분석을 실행하는 것입니다.
당사의 고처리량 LDH 세포독성 분석은 바이오매스를 추정하고, 세포 수를 계산하고, 세포와 조직의 건강 상태를 결정하는 데 유용합니다. LDH는 생존력 테스트뿐만 아니라 배양된 세포의 세포독성 테스트에도 널리 사용됩니다.
XTT
XTT 세포 증식 분석은 수용성 노란색 테트라졸륨염 XTT를 사용하여 세포 대사 활동을 검출합니다. 분석 중에 노란색 XTT는 대사 활성 세포의 탈수소효소에 의해 매우 착색된 포르마잔 염료로 환원됩니다. 이러한 전환은 생존 가능한 세포에서만 발생하므로 생성된 포르마잔의 양은 샘플 내 생존 세포의 수에 비례합니다. 분석에서 생성된 포르마잔 염료는 수용액에 용해되며 분광광도계를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량화됩니다. 궁극적으로 염료 흡광도는 각 웰의 대사적으로 활성화되고 생존 가능한 세포의 수에 비례합니다. (원천)
당사의 XTT 세포 증식 분석 키트는 높은 처리량 분석에 최적화되어 있으며 세포 손실이나 변동성을 유발할 수 있는 세척이나 기타 단계가 필요하지 않습니다. 당사의 키트는 방사성이 아니며 제약, 화학, 영양 및 환경 개입에 대한 반응으로 세포 증식 및 생존 능력을 정량화하는 데 이상적입니다.
WST-1
WST-1은 세포 생존성의 비색 평가에 사용되는 화합물입니다. 이 시약은 세포 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 테트라졸륨염 WST-1이 포르마잔으로 절단되는 과정을 기반으로 세포 증식을 측정하는 간단하고 정확한 방법을 제공합니다.
생존 가능한 세포 수가 증가하면 미토콘드리아 탈수소효소의 활성이 증가하고, 이는 형성되는 포르마잔 염료의 양이 증가하게 됩니다. 살아있는 세포에서 생성된 포르마잔 염료는 440nm에서 흡광도를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 MTT, XTT 또는 MTS 기반 분석보다 비방사성이며 빠르고 민감합니다.
현재 WST-1은 생존 가능성에 대한 가장 민감한 분석입니다. 여기에서 WST-1 세포 증식 시약에 대한 프로토콜에 대해 자세히 알아보세요. 분석은 동일한 미세역가 플레이트에서 수행할 수 있으며 추가 단계(세척, 수확, 세포 용해 등)가 필요하지 않습니다.
WST-8
WST-8(CCK-8이라고도 함)은 생존 가능성 테스트의 가장 발전된 최신 형태입니다. 최근에는 이전 MTT, XTT 및 WST-1보다 독성이 훨씬 적은 것으로 나타났습니다. (전체 기사는 여기에 있음) 실제로 WST-8은 세포외에서 작동하는 분석이므로 기능적으로 무독성입니다. WST-8 테트라졸륨 염은 세포 탈수소효소에 의해 조직 배양 배지에 용해되는 주황색 포르마잔 산물로 환원됩니다. 포르마잔은 분광광도계로 측정하여 대사적으로 활성화되어 생존 가능한 세포의 비율을 결정할 수 있습니다.
분석이 완료된 후 세포를 세척하고 단층 형태로 재사용할 수 있습니다.

고처리량 384웰 플레이트 분석(AKES081)에서 3D 호흡 오가노이드 세포 생존 가능성

Elodie Alessandri-Gradt 박사의 기술 노트1

소개
기도 감염은 전 세계 사망 원인 중 4위를 차지하며, 주로 바이러스 감염에 의해 발생합니다. Apical-ut 호흡기 오가노이드는 인간의 호흡기 상피를 모방한 혁신적인 3D 모델입니다2. 바이러스 진입, 병독성, 세포 발병기전, 약물 안전성, 면역 반응 분석, 심지어 고처리량 약물 스크리닝 연구를 포함하여 의료 바이러스학 분야의 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다.
그러나 오가노이드와 3D 모델의 복잡한 특성으로 인해 이러한 구조에서 세포 증식, 생존 가능성 및 세포 독성을 정확하게 측정할 수 있는 시약이 부족합니다. 이 연구에서 우리는 Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay가 처리량이 높은 384웰 형식으로 3D 호흡 유기체의 세포 생존력을 측정하는 탁월한 시약이며 다른 주요 시약에 비해 훨씬 우수한 결과를 제공한다는 것을 보여줍니다.
분석 원리
Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay는 세포 배양 상층액과 3D Organoid 모델에서 직접 살아있는 생존 세포의 수를 정량화하는 고감도 1단계 키트입니다. 이 키트는 증식 및 세포 독성 연구를 위한 탁월한 선택이며 높은 처리량의 384웰 형식의 Apical-Out 기도 오가노이드뿐만 아니라 2D 세포 배양에서도 검증되었습니다. 이 기술은 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 WST-8 테트라졸륨 염이 450nm에서 측정 시 생존 세포 수에 정비례하는 오렌지색 생성물로 환원되는 것을 기반으로 합니다. WST-8은 세포 독성 프로필이 낮은 세포 배양 배지에 매우 잘 용해되며 전처리나 세척 단계 없이 배양된 세포에 직접 첨가할 수 있습니다. 높은 처리량과
민감한 실험, 특히 24시간 또는 48시간과 같이 더 긴 배양 단계가 필요한 실험. 이 키트는 MTS, MTT, PrestoBlue 또는 XTT와 같은 다른 Tetrazolium 시약보다 훨씬 높은 감도와 낮은 세포 독성을 제공합니다.
재료 및 방법
다중 모드 리더
바닥이 투명한 384W 다크 플레이트 Corning®
DMSO(시그마)
규약
- 75~100개/웰 집에서 만든 정점 아웃 오가노이드를 384w 플레이트에 3회 분배했습니다.
- 0.1% 및 10% DMSO를 음성 및 양성 대조군으로 최종 용량 50μl에 첨가했습니다.
- 플레이트를 5% CO2, 37°C에서 2일 동안 배양했습니다.
- 5μl의 3D Organoid Cell Viability Assay CCK8 완충액 또는 Prestoblue 시약을 각 웰에 첨가하고
1시간, 3시간 또는 하룻밤 동안 배양됩니다.
- 3D Organoid Cell Viability Assay CCK-8 완충액이 포함된 웰의 흡광도는
Ex 535nm/em 595nm에서 PrestoBlue 시약을 함유한 제품은 490nm에서 측정되었습니다.
- 세포 생존율(%)은 OD 시료, 대조군 및 바탕 시료로부터 계산되었습니다.
결과 및 토론
표 1: Spectra로 얻은 데이터시트.
A) 3D Apical-out 오르가노이드를 0.1% DMSO로 처리하고 1시간, 3시간 및 밤새 배양한 후 Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay 또는 ThermoScientific PrestoBlue 시약을 사용하여 세포 생존력을 측정했습니다. 오가노이드에 대한 3D 오가노이드 세포 생존율 분석으로 얻은 세포 생존율은 PrestoBlue 시약을 사용할 때 생존율이 감소한 것과 비교하여 모든 시점에서 100% 이상이었습니다.
B) 3D Apical-out 오르가노이드를 10% DMSO로 처리하여 세포 사멸을 시작하고 생존력을 1시간, 3시간 및 밤새 배양한 후 Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay 또는 ThermoScientific PrestoBlue 시약을 사용하여 측정했습니다. 셀
3D 오가노이드 세포 생존율 분석으로 얻은 오가노이드의 생존율은 0.5%에서 5.9% 범위의 생존율 감소를 감지했습니다.

결론


3D 오르가노이드 세포 생존력 분석은 다른 레자주린 기반 방법과 비교하여 정점 외기도 3D 오르가노이드 세포 생존력에 대한 탁월한 결과를 제공했습니다.

참고자료

바이러스학과 DYNAMICURE INSERM UMR 1311, UNIRouen, UNICAEN
Stroulios G, 브라운 T, Moreni G, 외. 바이러스 감염 연구 및 항바이러스제 스크리닝을 위한 플랫폼인 정점외 기도 오가노이드. Sci Rep. 2022;12(x1):7673. 2022년 5월 10일 게시. doi:10.1038/s41598-022-11700-z
8th Aug 2024 Sana Riaz

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