Competitive ELISA Protocol

Competitive ELISA 분석은 샘플 내 분석물의 양을 측정하거나 다른 조건들에서 분석물 양의 변화를 측정하는데 이용됩니다. Competitive ELISA 분석은 샘플 내 다양한 대사체, 호르몬 및 단백질을 효과적/정량적/경제적으로 측정할 수 있습니다. Sandwich ELISA와 유사하게, competitive ELISA는 일차 항체 및 효소와 연결된 이차항체를 이용하여 샘플내 분석물의 양을 측정합니다.

Competitive ELISA 분석은 코르티솔(Cortisol), T3, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 세로토닌(serotonin) 과 같은 다양한 호르몬 및 신호물질(signalling molecules)을 분석하는데 훌륭한 도구입니다. Competitive ELISA는 고가의 장비를 사용하지 않고도, 분석물을 측정할 수 있는 저렴하고 효과적이며 빠른 연구방법을 제공합니다.

• 복합적 샘플 내의 분석물 측정: competitive ELISA분석의 장점은 복합적인 생물학적 샘플 내에 있는 관심 분석물을 분석할 수 있는 능력에 있습니다. 분석과정에서 결합항체(capture antibody)와 샘플을 혼합하는데, 이는 효과적으로 결합항체-분석물 복합체(the capture-analyte complex)를생성하도록 해줍니다.

• Negative controls에서 양성 결과가 도출될 수 있습니다: well이 제대로 차단되지 않았을 경우, 항원이나 이차항체가 well에 비특이적 결합을 할 수 있습니다.

• 시그널이 샘플 내 항원의 양과 반비례합니다: 항원이 고농도로 포함된 샘플의 경우, 약한 신호가 생성되고 분석 범위에 영향을 줄 수 있습니다. 적절한 농도 범위에서 측정하기 위해 샘플의 희석 과정이 필요할 수 있습니다.

Competitive ELISA 분석은 포획항체(capture antibody)가 샘플 내의 항원과 경쟁하는 원리를 기반으로 합니다. 첫째로, 표지 되지 않은 결합항체(unlabeled capture antibody)가 분석하고자 하는 항원을 포함한 샘플과 함께 배양됩니다. 이때 항체-항원 복합체가 형성됩니다. 이 과정에서 과잉의 항체가 가해지고, 결과적으로 배양 과정 후에 결합하지 않은 항체(free antibody)가 남게 됩니다.

다음 단계에서, 분석하고자 하는 항원(inhibitor antigen)이 미리 코팅된 ELISA plate에 항체-항원 복합체를 가합니다. 첫번째 단계에서결합하지 않고 남은항체가 plate에 있는 inhibitor antigen에 결합하게 됩니다. 미리 생성된 항체-항원 복합체는 다음 세척단계에서 제거됩니다.

다음으로, 효소와 결합된 검출항체(enzyme-linked detection antibody)를 plate에 가합니다. 이는 inhibitor antigen에 결합된 일차항체에 결합하게 됩니다. 마지막으로, 기질(substrate)를 가하면 비색변화가 일어납니다. 신호의 세기는 샘플 내의 항원의 양과 반비례하여 나타납니다.

아래의 프로토콜은 Competitive ELISA kit을 위한 예시입니다. Competitive ELISA kits은 샘플 내 분석물의 검출 및 정량화를 가능하게 합니다. 이를 통해 연구자들은 샘플 안의 분석물의 양을 계산할 수 있습니다. 이는 단백질 농도 증가, 단백질의 인산화(phosphorylation) 또는 단백질 농도의 감소를 측정하는데 매우 유용합니다.