흐름 세포 측정 (Flow Cytometry) 프로토콜 | 10가지 힌트 & 팁

흐름 세포 측정 샘플 고정을 위한 이 프로토콜은 세포 주기 분석 및 DNA 라벨링을 위해 세포를 준비하는 빠른 프로토콜이다. 이 프로토콜은 세포 주기(요오드화 프로피듐으로 염색한 경우 Cell Cycle), G1, S 및 G2/M)의 위상을 측정하는 데 도움이 됩니다.

1. 270 x g에서 5분간 원심분리하여 처리된 검체로부터 K562 세포를 채취하여 세포를 펠릿 처리합니다
2. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입하십시오.
3. 펠릿을 얼음-냉인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한다
4. 270 x g에서 5분간 원심 분리하십시오.
5. PBS 200 µl에 있는 셀을 다시 일시 중단합니다
6. 샘플 분석에 앞서 밤새 4°C에서 배양하기 전에 얼음으로 찬 에탄올(70%(v/v)) 2ml를 추가합니다.

1. 고정 시료를 270 x g에서 5분간 원심분리한다.
2. 에탄올을 흡입한 후 PBS 500µl에 다시 담급니다
3. RNase A(30 mg/ml)와 프로피듐 요오드화물(300 µM)을 넣고 섞는다.
4. 시료를 37 °C에서 30분간 배양한 후 분석한다.
5. Cell Cycle Profile은 COLTER© EPICS© XL-MCL Flow Cytometer를 사용하여 분석되었습니다

이 프로토콜 Flow cytometry는 CXCR4와 같은 수용체의 세포 표면 발현에 대한 특정 처리의 효과를 결정하는 데 사용되었다.

1. 5 x 105 세포/ml의 Jurkat T 세포와 혈청은 혈청 프리 RPMI + 0.5% BSA 실험 전 2시간 동안 굶는다.
2. 불연속 교반 조건에서 100 ng/ml SDF-1α로 셀 자극
3. 벤치탑 원심분리기에서 850 xg에서 30초 동안 원심분리를 통해 활성화를 중지합니다
4. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포 세척
5. 1% BSA/PBS에서 세포 표면 수용체에 대한 피코에리티린(PE) 표지 항체로 염색하고 얼음에서 30분간 배양한다.
6. 1% BSA/PBS로 두 번 세척
7. 얼음 위에 1% PFA를 고정하세요
8. 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하거나 유동 세포 측정법으로 즉시 분석합니다.

CXCR4와 같은 수용체의 세포 표면 발현은 DAKO CyAn ADP(Advanced Digital Processing)로 측정되었다

결과는 히스토그램을 생성하기 위해 관련 Dako Summit(버전 4.3) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 데이터는 통계 분석을 거쳐 그래프 패드 프리즘을 사용하여 그래프화되었다.

이것이 당신의 실험의 시작이고 가장 중요한 부분입니다. 부착된 세포를 사용하든 조직에서 파생된 세포를 사용하든 검체 준비가 완전히 최적화되었는지 확인합니다. 세포가 올바르게 수확되지 않으면 세포 생존 능력이 저하될 수 있습니다. 또한 효소 절차의 사용은 연구 중인 마커의 발현에 어떠한 영향도 미치지 않아야 한다.

형광색소를 선택하기 전에 고려 중인 형광색소의 레이저, 필터 및 방출 스펙트럼 특성을 알아야 합니다. 또한 사용할 계측기의 기능을 알고 있어야 합니다. 어떤 두 세포계도 그들의 능력이 같지 않다. 지식이 풍부한 직원이 있는 플로우 사이토메트리 코어를 가지고 있다면, 그들이 가장 좋아하는 4, 5, 6색 패널이 무엇인지 반드시 물어보십시오. 또한 특정 기기에서 특정 색상의 한계가 무엇인지 알려줄 수 있어야 합니다. 항상 밝은 형광색소를 선택하여 낮은 밀도로 발현되는 항원을 탐지하고 어두운 형광색소를 선택하여 높은 밀도로 발현되는 항원을 탐지해야 합니다. 형광색소의 선택은 보상에도 중요하며, '밝은' 형광색소가 스펙트럼 중복 문제를 일으킬 가능성도 고려해야 한다.

가능하면 죽은 세포를 식별하고 제거하는 것이 특정한 얼룩을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 죽은 세포는 막의 완전성을 상실한 세포를 투과하는 DNA 염료를 사용하여 검출될 수 있다.

Doublets은 두 개의 세포가 서로 붙어 하나로 분석될 때 발생한다. 이는 레이저 질문 지점을 통과하는 '셀'의 형광 강도를 거짓으로 증가시킬 것이다. 게이트 아웃은 순방향 산포 INT 대 순방향 산포 Time-of-Flight(ToF) 또는 측면 산포 INT 대 측면 산포 비행 시간(ToF)을 사용하여 창을 만들어 두 배로 증가합니다. 이후, 세포 덩어리를 제외하기 위해 분석하기 전에 세포를 여과한다.

이상적인 세계에서는 샘플을 즉시 분석해야 하지만 항상 그렇게 되는 것은 아닙니다. 샘플을 즉시 분석할 수 없는 경우에는 100µl의 고정제(예: 1-2% 포름알데히드)를 사용하여 최대 24시간 동안 빛으로부터 보호된 상태로 4°C에서 보관하십시오.

유동 세포 측정 실험의 최적화 중 중요한 단계는 시약(항체) 적정이다. 이것은 배경을 최소화하면서 형광 신호의 특이성과 강도를 향상시키는 데 도움이 될 것이다.

유동 세포 측정 실험의 최적화 중 중요한 단계는 시약(항체) 적정이다. 이것은 배경을 최소화하면서 형광 신호의 특이성과 강도를 향상시키는 데 도움이 될 것이다.

주변 빛에 의한 형광색소 열화를 방지하기 위해 착색되었거나 착색 중인 셀이 들어 있는 플레이트 또는 튜브는 샘플을 호일 또는 다른 차광 메커니즘으로 덮어서 보호해야 합니다